بررسی کارایی ایمنی‌زایی پپتیدهای اختصاصی ایمونوژن ساخته‌شده علیه ویروس تب برفکی

نوع مقاله : علوم پایه (بیوشیمی، آناتومی، جنین، بافت شناسی و فیزیولوژی)

نویسندگان

1 بخش تحقیق و تولید واکسن‌های باکتریایی انسانی، مؤسسه تحقیقات واکسن و سرم سازی رازی، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی (تات)، کرج، ایران

2 آزمایشگاه مرجع بخش بیماری تب برفکی، مؤسسه تحقیقات واکسن و سرم سازی رازی، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی (تات)، کرج، ایران

3 بخش تحقیق و توسعه، کیت و آنتی بادی، مؤسسه تحقیقات واکسن و سرم سازی رازی، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی (تات)، کرج، ایران

چکیده

زمینه مطالعه: تب برفکی یک بیماری ویروسی دامی می‌باشد که بسیار واگیر و گاهی کشنده است. این ویروس هم مانند سایر ویروس­ها، به‌طور مداوم تکامل و جهش می­یابد، بنابراین یکی از مشکلات واکسیناسیون علیه آن، تنوع بسیار زیاد سروتیپ­ها می‌باشد. هیچ محافظت متقابل بین سروتیپ­ها وجود ندارد. علاوه‌بر‌این، دو سویه در یک سروتیپ معین ممکن است توالی نوکلئوتیدی داشته باشند که برای یک ژن معین تا 30 درصد متفاوت باشد. این بدان معناست که واکسن­های تب برفکی باید کاملاً خاص برای سویه درگیر باشند. با‌توجه‌به اهمیت واکسن تب برفکی و نقش آن در سلامت و امنیت غذایی، رویکرد استفاده از کاندیدهای جدید پپتیدی جهت ایمن‌سازی می­تواند کمک‌کننده باشد.
هدف: مطالعه حاضر با هدف بررسی اثر ایمنی‌زایی پپتیدهای اختصاصی ایمونوژن ساخته‌شده علیه ویروس تب برفکی انجام شد.
روشکار: پس از مطالعات بیوانفورماتیکی 2 توالی 14 و 20 آمینواسیدی از توالی­های پپتیدی نواحی ایمونوژنیک پروتئین VP1 ویروس تب برفکی O2016، طراحی و سنتز شدند. سپس پپتید‌ها با ادجوانت پایه آلومینیوم هیدروکساید فرموله شده و تزریقات در 3 گروه­ خرگوش در فواصل زمانی 2 هفته‌ای و به تعداد 5 مرتبه انجام شد. در ادامه با استفاده از تست الایزای غیرمستقیم پپتیدی میزان تولید آنتی‌بادی نسبت به نمونه­های کنترل منفی (گوساله­های غیرواکسینه) علیه پپتیدهای چسبانده‌شده به پایه BSA بررسی و آنالیز شد.
نتایج: مطابق نتایج، اولاً هر دو پپتید در حالت کونژوگه با BSA قادر به تحریک سیستم ایمنی در خرگوش بودند و آنتی‌بادی‌ها علیه این پپتیدها، همچنین علیه ویروس کامل تب برفکی به‌طور متقاطع نیز با یکدیگر قابلیت واکنش داشتند. همچنین بیشترین ایمنی‌زایی در تست الایزا مربوط به توالی 20 آمینواسیدی با غلظت 300 میکروگرم در چاهک در چکر بورد الایزا و 400 میکروگرم در دُز تزریق به خرگوش بود.
نتیجه­گیری نهایی: این دو پپتید در صورت مطالعات بیشتر می­توانند کاندیدهای مناسبی جهت ارزیابی پاسخ ایمنی علیه ویروس تب برفکی در تست­های سرولوژی، بررسی حیوانات واکسینه و غیر‌واکسینه و مطالعات ایمن‌سازی باشند.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Investigating the Efficiency of Immunogenicity of Specific Peptides Produced Against FMD Virus

نویسندگان [English]

  • Fatemeh Tahoori 1
  • Mohammad Mehdi Ranjbar 2
  • Rasool Madani 3
  • Seyed Mahmood Azimi Dezfoli 2
  • Fariba Golchinfar 3
  • Arash Ghanizadeh 3
1 Department of Human Bacterial Vaccines Production and Research, Razi Vaccine and Serum Research Institute, Agriculture Research, Education and Extension Organization (AREEO), Karaj, Iran
2 Department of Foot and Mouth Disease Reference Laboratory, Razi Vaccine and Serum Research Institute, Agriculture Research, Education and Extension Organization (AREEO), Karaj, Iran
3 Department of R&D, Kit and Anti-Body Laboratory, Razi Vaccine and Serum Research Institute, Agriculture Research, Education and Extension Organization (AREEO), Karaj, Iran
چکیده [English]

BACKGROUND: Foot-and-mouth disease is a highly contagious and sometimes fatal viral disease affecting livestock. Like other viruses, this virus continuously evolves and mutates, posing a significant challenge to vaccination due to the vast diversity of serotypes. There is no cross-protection among the serotypes, and two strains within a specific serotype may have nucleotide sequences that differ by up to 30% for a particular gene. This indicates that foot-and-mouth disease vaccines must be highly specific to the strain involved. Given the importance of the foot-and-mouth disease vaccine and its role in health and food security, using new peptide candidates for immunization could be beneficial.
OBJECTIVES: The aim of this study was to investigate the immunogenic effects of specific peptides produced against the FMD virus.
METHODS: After conducting bioinformatics studies, two sequences of 14- and 20-amino acid peptides from the peptide sequences of the immunogenic regions of the VP1 protein of foot-and-mouth virus O2016 were designed and synthesized. The peptide formulation (conjugated to BSA) was then prepared with aluminum phosphate adjuvant, and injections were administered to groups of nine rabbits at two-week intervals for a total of five times. Subsequently, the amount of antibody production was investigated and analyzed using the indirect peptide ELISA test, comparing it to the negative control samples (non-vaccinated calves) against the peptides attached to the BSA base.
RESULTS: The results showed that both peptides were capable of stimulating the immune system in rabbits, and antibodies against these peptides, as well as against the complete foot-and-mouth disease virus, demonstrated cross-reactivity with each other. Additionally, the highest immunogenicity in the ELISA test was related to the 20 amino acid sequence at a concentration of 300 µg per well in the checkerboard ELISA and 400 µg per dose injected into the rabbits.
CONCLUSIONS: These two peptides, with further research, could serve as suitable candidates for evaluating the immune response against foot-and-mouth disease virus in serology tests, examining vaccinated and non-vaccinated animals, and conducting immunization studies.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Diagnosis
  • ELISA
  • Foot and mouth disease (FMD) virus
  • Immunization
  • Peptide

مقدمه

بیماری تب برفکی   (Foot-and-Mouth Disease, FMD)یک بیماری بسیار واگیر است که سبب زیان­های اقتصادی زیادی در دام­ها می‌شود. این بیماری ناشی از یک ویروس RNA  بسیار متغیر از خانواده پیکورناویریده (Picornaviridae) و جنس آفتوویروس (Aphthovirus) می­باشد. این ویروس دارای 7 سروتیپ به نام‌های ‌A،O،C،Asia1،SAT1،SAT2‌ و SAT3 ‌است (1، 2). هر ویریون حاوی ژنوم RNA تک‌رشته با طول حدود 8500 جفت‌باز و یک ساختار کپسیدی 20 وجهی، دارای 60 کپی پروتئین­های ساختمانی VP4 -VP1 و همچنین 7 پروتئین غیرساختمانی است (3). عفونت زمانی اتفاق می‌افتد که ذرات ویروسی به داخل سلول میزبان راه پیدا می‌کند و ویروس سلول میزبان را مجبور به تولید هزاران کپی از خود می­‌کنند که نهایتاً با انهدام سلول، ذرات ویروسی در خون رها می­شوند. این ویروس از‌نظر آنتی‌ژنی دائماً در‌حال تغییر است و همین موضوع تأثیر واکسیناسیون را با اشکال روبه‌رو می­کند (4، 5). مقاومت عامل بیماری در طبیعت همراه با سایر عوامل، ازجمله تغییرات آنتی‌ژنتیکی ویروس و پیدایش زیرتیپ­های جدید آن و مهم­تر از همه توان ایجاد بیماری در گونه­های مختلف نشخوارکنندگان اهلی و وحشی و وجود دام­های ناقل و حامل ویروس تب برفکی که اغلب متعاقب عفونت طبیعی پدیدار می‌شوند، در بقای عفونت و بیماری در یک جمعیت و منطقه تأثیر دارند و کنترل این بیماری را بسیار مشکل و همراه با هزینه‌های کلان می‌کند (6).

طیف وسیع میزبانی و تنوع سرو‌تیپ­ها و تحت تیپ­های ناشی از تغییرات آنتی‌ژنیکی باعث بروز اپیدمی­هایی از این بیماری در جهان و ایران می­شود و مبارزه و کنترل این بیماری را مشکل کرده است. آنتی‌بادی­های خنثی‌کننده، معیار ارزیابی مهم از جهت محافظت علیه بیماریFMD  و سایر پیکورنا ویروس­ها می­باشند. درک نوع میان‌کنش میان آنتی‌بادی­ها و ویروس FMD در تهیه آنتی‌ژن­های اپی‌توپی (پپتیدی) و تهیه آنتی‌بادی جهت مصارف تشخیصی، تفکیک تایپ­ها و ساخت کیت­های تشخیصی و واکسن بسیار حائز اهمیت است.

در ایران سروتیپ­های Asia1 -O-A عمده­ترین ویروس­های مولد تب برفکی می‌باشند که در بین آن‌ها سروتیپ­های A و O حدود 50 سال در گردش بوده است (7).

آنتی‌ژن­هایی که در واکسن­ها در حال حاضر برای کنترل تب برفکی استفاده می­شوند، ماحصل غیر‌فعال‌سازی ویروس­ها توسط مواد شیمیایی­اند که امولسیون­هایی همراه با ادجوانت می‌باشند و به‌صورت تزریقی مورد استفاده قرار می­گیرند. از این آنتی‌ژن‌ها جهت توسعه کیت‌های الایزا SPC-ELISA (Solide phase competitive-ELISA) نیز استفاده می­شود. با وجود استفاده گسترده از این روش، ایمن‌سازی با واکسن­های حاوی ویروس غیر‌فعال‌شده توسط مواد شیمیایی مضراتی دارد، از‌جمله ناقص غیرفعال شدن ویروس، دشواری تشخیص حیوانات واکسینه‌شده از حیوانات آلوده و نیاز به واکسیناسیون مجدد با سویه­های ویروسی که از‌نظر آنتی‌ژنی مشابه سویه­های در چرخش می‌باشند. ضمن اینکه برای هر بار تهیه واکسن به پاساژ مجدد نیاز می‌باشد که همین امر خود به تضعیف و یا حتی تغییر در ویروس منجر خواهد شد. بنابراین واکسن­های زیرواحد (subunit)، واکسن­های نوترکیب، DNA واکسن­ها و واکسن­های پپتیدی به‌طور وسیعی مورد مطالعه قرار گرفته­اند تا جایگزین­های امن و مؤثری برای واکسن­های متداول تب برفکی یافت شود (8).

در صورتی زیرواحدهای پروتئینی می­توانند به‌عنوان واکسن­های موفق به کار برده شوند که بتوانیم فعال­ترین اپی­توپ­های آن‌ها را تعیین و پپتیدهای مشابه این اپی­توپ­ها را سنتز کنیم و سپس به‌عنوان واکسن به کار بریم (9، 10). بنابراین به‌دست آوردن پروتئین مورد‌نظر از ارگانیسم، شناخت قطعات پپتیدی مشتق از آن و در‌نهایت شناسایی فعالیت ایمنی‌زایی آن‌ها لازم است (11).

مزایای این‌گونه واکسن­ها شامل سهولت سنتز تحت شرایط کنترل‌شده و همچنین تولید کاملاً ایمن آن‌ها می­باشد. هرچند پپتیدهای سنتزی به‌عنوان واکسن، به‌دلیل اثرگذاری پایینی که ایجاد می­کنند تاکنون نتوانسته‌اند فاز بالینی را طی کنند. استفاده از کونژوگه­ها و ادجوانت­ها و روش­های دارورسانی هدفمند نیاز است تا تحریک کافی و مناسب در سیستم ایمنی ایجاد شود و پاسخ ایمنی طولانی­تری رخ دهد (12-15).

الایزا یکی از آزمایش‌های سرولوژیکی سریع برای تشخیص آنتی‌بادی‌های اختصاصی علیه پاتوژن‌ها می‌باشد. پروتئین مورد ‌استفاده جهت الایزا باید خواص آنتی‌ژنی، حساسیت، خلوص و قابلیت دسترسی برای سیستم ایمنی را از خود نشان دهد (1، 2). بنابراین توسعه رویکردهای سرولوژیکی مبتنی بر پپتیدهایی با قابلیت ایمنی‌زایی و تولید‌کننده آنتی‌بادی­های خنثی‌کننده، برای تشخیص قابل اعتماد و ردیابی آنتی‌بادی‌های علیه سروتیپ‌های مختلف تب برفکی ارزشمند می‌باشد. از دید دیگر در ارزیابی اثربخشی واکسن تب برفکی و نظارت بر سطح ایمنی گله پس از واکسیناسیون تب برفکی بسیار حائز اهمیت است. از سوی دیگر به‌دلیل نوع انتخاب این پپتید نتایج آن باید بتواند با تست خنثی‌سازی سرم (Serum neutralization test) برابری کند.

برای بهبود عملکرد الایزا به‌عنوان رایج­ترین روش در تشخیص FMD، تمهیدات زیادی انجام شده است که عمدتاً بر توسعه آنتی‌ژن­های پوششی جدید نظیر پپتیدها در کیت‌های تشخیص سرمی و آنتی‌بادی­های منوکلونال جدید (mAbs) یا چند‌وجهی (Polyspecific) به‌عنوان آنتی‌بادی­های به دام انداخته‌شده در هر دوی کیت‎های جستجوی آنتی بادی و آنتی ژن تمرکز دارند (16).

در این مطالعه 2 توالی 14 و 20 آمینواسیدی از توالی­های پپتیدی نواحی ایمونوژنیک پروتئین VP1ویروس تب برفکی با روش‌های بیوانفورماتیکی انتخاب و سنتز شدند. برخی شاخص­ها در انتخاب این دو توالی مد‌نظر بوده است. در این خصوص می­توان به مواردی از قبیل قدرت آنتی‌ژنی، حراست و تکرار‌پذیری آن‌ها در سویه­های مختلف ویروس تب برفکی و وجود اپی‌توپ­های B cell (به‌دلیل اهمیت این رده سلولی در القای پاسخ ایمنی همورال و داشتن نقش کلیدی در مهار تکثیر ویروس تب برفکی در بدن دام) اشاره کرد.

پس از تخلیص و شناسایی توالی­ها، هر پپتید به‌صورت جداگانه با ادجوانت فرموله‌شده و همراه با کنترل (PBS) به حیوان مدل تزریق شد. علاوه‌بر کنترل علائم بالینی، خون‌گیری انجام شد و با استفاده از تست الایزای پپتیدی توسعه داده‌شده میزان تولید آنتی‌بادی نسبت به نمونه کنترل منفی بررسی شد (تصویر 1).

مواد و روش­ کار

مواد شیمیایی و بیولوژیک: تمام آمینو‌اسیدهای محافظت‌شده، رزین 2-کلروتریتیل کلراید و معرف کوپل‌کننده 2-(H1-بنزوتری آزول-1-ایل)-3،3،1،1-تترامتیل آمینیوم تترا فلوئورو بورات (TBTU) از کمپانی چینی GL Biochem‌، سرم گاوی رفرنس (BRS) از مؤسسه انگلیسی پیربرایت، پروتئین آلبومین سرم گاوی، تویین-20 (P1379)، کراس لینکر گلوتر آلدئید، سوبسترای تترا متیل بنزیدین TMB و آنتی‌بادی بزی ضدخرگوشی کونژوگه با HRP از کمپانی سیگما-آلدریچ و سایر حلال‌ها و ترکیبات شیمیایی از کمپانی مرک آلمان خریداری شدند. همچنین ادجوانت­های آلومینیوم هیدروکساید و آلومینیوم فسفات به‌صورت نوزاد تهیه شد.

حیوانات تحت آزمایش: حیوان مدل مورد‌استفاده خرگوش نر سفید نژاد نیوزیلندی بود که از بخش حیوانات آزمایشگاهی مؤسسه واکسن و سرم‌سازی رازی تهیه شد. بر‌اساس وزن و سن (سن 6 هفتگی)، خرگوش­ها تهیه و سپس به 3 گروه تقسیم شدند:

گروه 1: 3 خرگوش دریافت‌کننده پپتید 20 آمینواسیدی فرموله‌شده به میزان 400 میکروگرم در هر دُز با ادجوانت آلومینیوم هیدروکساید. نیمی از فرموله به‌صورت زیرجلدی و نیم دیگر به‌صورت عضلانی تزریق شد. دُز یادآور 200 میکروگرم در نظر گرفته شد.

گروه 2: 3 خرگوش دریافت‌کننده پپتید 14 آمینواسیدی فرموله‌شده به میزان 400 میکروگرم در هر دُز با ادجوانت دو‌گانه (آلومینیوم هیدروکساید/آلومینیوم فسفات). نیمی از فرموله به‌صورت زیرجلدی و نیم دیگر به‌صورت عضلانی تزریق شد. دُزهای یادآور 200 میکروگرم در نظر گرفته شد.

گروه 3: 3 خرگوش به عنوان کنترل منفی آزمایش که مشابه با نمونه‌های مربوط به سرم خرگوش در روز صفر است.

خرگوش­ها در روز صفر مورد تزریق اولیه و سپس در روز 14 و 28 مورد تزریق یادآور قرار گرفتند (یادآور نیمی از دُز شروع بود) و سپس خون‌گیری به فاصله 7 روز پس از آخرین تزریق انجام شد. نمونه­های خون با 3500 دور در دقیقه، برای مدت 15 دقیقه سانتریفیوژ و سرم­ها جدا شدند و در میکروتیوب در دمای 20- درجه سانتی‌گراد نگهداری شدند.

دستگاه­های مورد‌استفاده: محصولات به‌دست‌آمده پپتیدی به کمک دستگاه کروماتوگرافی مایع تهیه­ای شرکت Knauer آلمان با پمپ دوگانه، آشکارساز UV2500 تک‌رنگ و ستون C18 (120×20 میلی­متر، 100 آنگستروم، 10 میکرومتر) خالص شدند. جهت اطمینان از خالص شدن ترکیب از دستگاه کروماتوگرافی تجزیه­ای شرکت Agilent با پمپ چهارگانه، دتکتور طول موج چندگانه و ستون C18 (150×6/4 میلی­متر، 100 آنگستروم، 5 میکرومتر) استفاده شد. برای خشک کردن نمونه پپتیدی خالص از فریزدرایر آلمانی Christ، مدل Alpha 1-2 LD plus استفاده شد.

برای شناسایی محصول خالص‌شده از Ms-LC، دستگاه Agilent Triple Quadrupole LC/MS 6410 و طیف‌سنج جرمی با مشخصات یونیزاسیون‌کننده الکترواسپری با منبع ولتاژ 5/3 کیلوولت فشار گاز نبولایزر  50 پوند بر اینچ مربع  استفاده شد.

در طی مراحل الایزا از میکروپلیت 96 خانه پلاستیکی Maxiport برند Nunc، برای جداسازی پلاسما از سانتریفیوژ آلمانی Hettich مدل Rotofix 32A، برای کنترل دما از انکوباتور آلمانی Memmert مدل Inc246، برای شست‌وشوی میکروپلیت از الایزا واشر ایرانی Hydroflow مدل 2CH-8M و برای خوانش جذب از دستگاه الایزا ریدر آمریکایی Chromate مدل 4306 استفاده شد.

بیانیه اخلاقی: بخش کار با حیوانات مطالعه حاضرتحت نظارت کمیته اخلاق کار با حیوانات آزمایشگاهی مؤسسه تحقیقات واکسن و سرم‌سازی رازی (با کد اخلاق RVSRI. REC. 98.019) و در شرایط نگهداری و تغذیه استاندارد حیوانات توسط افراد خبره و متخصص انجام شد.

انتخاب توالی­های پپتیدی: بررسی مطالعات گذشته‌نگر نشان داد در ناحیه لوپ G-H، 2 جایگاه شاخص آنتی‌ژنیکی یا ایمونودومیننت وجود دارد. جایگاه اول که اهمیت بیشتری دارد، توالی اسید‌آمینه­های 141-160 و جایگاه دوم توالی 198-211 می­باشد (17، 18). در مطالعه حاضر این دو ناحیه به‌ترتیب پپتید A و B نامیده شد و به روش بیوانفورماتیک مورد بررسی قرار گرفتند.

برای این منظور ابتدا توالی نوکلئوتیدی  VP1در ویروس تب برفکی سویه O2016 بررسی شد. روش کار به‌طور خلاصه از این قرار بود: ابتدا استخراج RNA ژنومیک از 200 میکرولیتر سوسپانسیون ویروسی O2016 توسط کیت سیلیکا فیلتر (High Pure Viral RNA Extraction Kit, Roche) انجام شد. سپس ژن 1D توسط کیت One-Step RT-PCR (Titanium® tube, Roche)  و پرایمر اختصاصی تایپ O به طول bp800 تکثیر شد. سپس محصول PCR جهت تعیین توالی به روش خوانش دو‌طرفه (Eurofins MWG Operon LLC) ارسال شد. ویروس O2010 که تا سال 1395 در واکسن مورد استفاده قرار می­گرفت نیز با همین روش تعیین توالی شده است. پس از بررسی توالی نوکلئوتیدی و کسب اطمینان از کیفیت توالی، ژن مزبور توسط نرم‌افزار Bioedit   نسخه 7.2.5 به اسید‌آمینه ترجمه شد. توالی اسید‌آمینه VP1 در سایت NCBI توسط سرویس BLAST (Protein Biological Local Alignment Tool) بررسی شد. 24 عدد از ویروس­های همولوگ(E=0)  با ویروس مزبور از Genebank انتخاب و با یکدیگر مقایسه شدند. جایگاه­های آنتی‌ژنیک پروتئین VP1 در 24 ویروس انتخاب‌ و ویروس­های O2016 و O2010 با یکدیگر مقایسه شدند و توالی پپتیدهای بررسی‌شده جهت تهیه واکسن پپتیدی استفاده شدند (19).

در مطالعه حاضر 2 توالی، 14 و 20 آمینواسیدی به‌ترتیب با سکانس­های EARHKQKIVAPVKQ و ATNVRGDLQVLAQKAARTLP انتخاب شدند. این توالی­ها جهت سنتز آزمایشگاهی استفاده گردیدند.

سنتز پپتید: توالی­های پپتیدی طبق استراتژی فاز جامد (Solid phase peptide synthesis (SPPS)) و مطابق پروتکل Fmoc بر بستر رزین 2-کلروتریتیل کلراید سنتز شدند. در هر مرحله کوپل شدن آمینواسیدها با معرف کایزر چک شد. پس از انجام سنتز با حفظ محافظت­های زنجیر جانبی و انتهای آمینی، توالی با استفاده از محلول 1 درصد تری فلوئورواستیک اسید از رزین جدا شد.

محافظت­های زنجیر جانبی آمینواسیدهای توالی­های سنتز‌شده با استفاده از واکنشگر K (5/82 درصد تری فلوئورو استیک اسید: 5/4 درصد تیوآنیسول: 5/4 درصد آب: 5/4 درصد فنول: 5/2 درصد اتیلن دی تیول: 5/1 درصد تری اتیل سیلان) جدا شدند. سپس حلال تحت خلأ تقطیر شد و حجم محلول به 2 میلی‌لیتر کاهش یافت. به محتویات باقیمانده به‌آرامی دی اتیل اتر اضافه شد. رسوب تشکیل‌شده پس از فیلتر شدن در آون خشک شد.

خالص‌سازی پپتیدها: محصول به‌دست‌آمده به کمک کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا تهیه­ای (Semi-Prep HPLC)، با برنامه گرادیان فاز متحرک (محلول فاز A، آب همراه با یک‌دهم درصد تری فلوئورو استیک اسید و فاز B حاوی مخلوط 70 به 30 از استونیتریل و آب همراه با یک‌دهم درصد تری فلوئورو استیک اسید) از 95 تا صفر درصد A با سرعت شارش 10 میلی­لیتر در دقیقه در طول موج 218 نانومتر خالص شد. سپس خلوص برش­های جمع‌آوری‌شده با استفاده از دستگاه کروماتوگرافی مایع با کارایی بالای تجزیه­ای مطابق برنامه گرادیان فاز متحرک (فاز A، آب همراه با یک‌دهم درصد تری فلوئورو استیک اسید و فاز B حاوی مخلوط 70 به 30 از استونیتریل و آب همراه با یک‌دهم درصد تری فلوئورو استیک اسید)، با سرعت شارش 1 میلی­لیتر در دقیقه در طول موج 218 نانومتر بررسی شد (جدول 1) و به دنبال آن با خارج کردن حلال آلی (استونیتریل)، محلول آبی باقیمانده با استفاده از دستگاه فریزدرایر (در دمای 55- درجه سانتی‎گراد با حداکثر قدرت پمپ برای ایجاد خلأ) خشک و پپتید خالص جمع‌آوری شد.

شناسایی پپتیدهای سنتز‌شده: جهت شناسایی و تأیید ساختار ترکیبات سنتز‌شده پپتیدی نمی­توان از روش­های معمول طیف‌سنجی نظیر رزونانس مغناطیسی هسته­ای پروتون و کربن بهره گرفت، چرا‌که به‌دلیل کثرت تعداد کربن و پروتون در این ترکیبات، طیف­های پیچیده­ای حاصل می­شود که به‌سختی می­توان آن­ها را تفسیر کرد. مگر آنکه طیف­های دو‌بعدی ترکیبات تهیه شوند و بر‌این‌اساس بتوان در‌مورد ساختار آن­ها اظهارنظر کرد. بنابراین بهترین روش برای این منظور استفاده از طیف‌سنجی جرمی است.

ارزیابی ایمنی‌زایی (فرمولاسیون و تزریقات نمونه­های پپتیدی): برای انجام تست میزان پاسخ ایمنی به پپتید، به ایمن‌سازی حیوان مدل و تهیه آنتی‌بادی هایپر ایمیون نیاز است. ایمن‌سازی خرگوش­ها با استفاده از پپتیدها انجام شد. برای تهیه سرم­های کنترل مثبت نیز از سرم‌های BRS (Bovine Reference Serum) سروتیپ O که سرم­های منووالان استاندارد علیه یک سروتیپ O تب برفکی با تست خنثی‌سازی (SN) 2 ≤  بودند، استفاده شد. ویروس­ها تغلیظ‌ و پپتیدها در بافر نمکی فسفات 011/0 مولار با 4/7 pH= حل شدند.

به سبب نقطه ایزوالکتریک (Isoelectric point، pI) (بالای 10)، خصوصیات فیزیکوشیمیایی و ترکیب ‌به‌خصوص پپتیدهای استفاده‌شده، ابتدا این پپتیدها به پروتئین حامل BSA به‌واسطه گلوترآلدئید کراس لینک شدند، سپس فرمولاسیون آن­ها با ادجوانت آبی آلومینیوم هیدروکساید به نسبت 1:3 (ژل آلومینیوم هیدروکساید به کمپلکس پپتید+BSA) انجام و به‌مدت 2 ساعت با سرعت 200 دور در دقیقه مخلوط شد.

آزمایش الایزا برای تعیین پاسخ آنتی‌بادی: از‌آنجا‌که pH ایزوالکتریک پپتیدها از بافر کوتینگ کربنات ـ بی‌کربنات بیشتر بود، ابتدا پروتئین حامل BSA به کف میکروپلیت چسبانده و سپس با استفاده از لینکر، سر آمینی‌پپتیدها به پروتئین BSA فراکشن V (با نسبت 20:1 از پروتئین به پپتید) متصل شدند. از‌این‌رو BSA در بافر کربنات بی‌کربنات (05/0 مولار) به مقدار 15 میکروگرم در هر میلی‌لیتر حل شد و کوتینگ با آن انجام گرفت. سپس پلیت با فویل آلومینیومی پوشانده و در ظرف پلاستیکی قرار داده شد. در گام بعدی پس از 1 شب انکوباسیون در 4 درجه سانتی‌گراد، مایع رویی (حاوی مقدار کمی پروتئین­های BSA متصل‌نشده) دور ریخته شد و سپس2 بار با PBS شست‌وشو صورت گرفت. در ادامه با به‌کارگیری سیستم متصل‌کننده­های متقاطع (گلوترآلدئید) به میزان 2/0 درصد (حجمی / حجمی)، آمینواسیدهای لایزین سطحی BSA جهت واکنشگری با گروه‎های آمینی‌پپتید فعال شدند. بر‌این‌اساس مقدار از پیش تعیین‌شده 300 نانوگرم از هر پپتید در هر چاهک بر‌اساس نتایج غلظت مناسب آنتی‌ژن (پپتید) به آنتی‌بادی با چکر بورد (Chequerboard test‌)، میزان 100 میکرولیتر از بافر حاوی پپتید به هر چاهک میکروپلیت 96 خانه­ای افزوده شد و بدین صورت کوتینگ دو‌مرحله­ای (یک مرحله کوتینگ BSA و مرحله دوم کوتینگ پپتید به BSA فعال‌شده با گلوترآلدئید) انجام گرفت. پس از 90 دقیقه انکوباسیون در انکوباتور 37 درجه سانتی‌گراد، محتویات دور ریخته شد و چاهک­ها 3 بار با بافر نمکی فسفات 011/0 مولار شسته شدند. چاهک­ها با 200 میکرولیتر بافر بلاکینگ (05/0 درصد حجمی/حجمی) PBS-Tween 20 حاوی 1 درصد کازئین مسدود‌سازی (Blocking) شدند. سپس 3 بار شست‌وشوی مجدد با بافر PBS-T صورت گرفت. در ادامه با سرم خرگوشی (رقیق‌شده 1:40) در 37 درجه سانتی‌گراد به‌مدت 1 ساعت انکوبه شدند. سپس 3 بار با PBS-T شست‌وشو صورت گرفت و انکوباسیون با آنتی‌بادی بزی ضد‌خرگوشی کونژوگه با HRP‌ انکوباسیون در دمای 37 درجه سانتی‌گراد به‌مدت 40 دقیقه صورت گرفت. سپس 3 بار با PBS-Tween 20  شست‌وشو صورت گرفت و پس از آن 100 میکرولیتر از TMB افزوده و انکوباسیون به‌مدت 20 دقیقه در فضای تاریک انجام شد. در پایان با افزودن 50 میکرولیتر اسید سولفوریک 1 مولار متوقف و جذب نوری (OD) در طول موج 450 نانومتر، با استفاده از الایزا ریدر خوانش شد. برای تأیید تکرار‌پذیری نتایج برای هر پپتید، تعداد تکرار متعدد در هر چاهک در نظر گرفته شد.

نتایج

نتایج بخش طراحی بیوانفورماتیکی پپتید و آنالیزها: پپتید 20 آمینواسیدی انتخابی با وزن مولکولی 46/2221 بود. pI آن 84/10 و میزان پایداری آن در آزمایشگاه 90/19=Instability index  و نیمه عمر آن نیز مطلوب است. باتوجه‌به خصوصیات فیزیکوشیمیایی، pI این پپتید نسبتاً بالا می­باشد که با استفاده از پروتئین حامل در تست­ها اصلاح می­‌شود. همچنین مقادیر آن در اسپکتروفتومتری به سبب عدم وجود برخی از آمینواسیدها در خوانش نوری، قابل‌بررسی نمی­باشد. نیمه عمر آن در حالت محلول و بدون نگهدارنده براساس محاسبات بیوانفورماتیکی (سرور Protparam)، در دمای آزمایشگاه حدود 6 ساعت است (مطابق با تست زمان واقعی (Real time) ‌کنترل کیفی در ارزیابی پایداری فراورده­های بیولوژیک) و امکان شروع تجزیه آن بعد از این زمان وجود دارد، بنابراین می­بایست به‌صورت پودر به‌طور مستمر در 20- درجه سانتی‌گراد نگهداری شود.

 شاخص Gravy پپتید 20 آمینواسیدی نشان می­دهد حل شدن این پپتید در آب‌مقطر یا PBS ایزوتونیک (pH فیزیولوژیک) کمی با تأخیر و اندکی کمتر از حالت معمول است، اما این امر برای پپتید 14 آمینواسید پایین‌تر از 1- بوده است. بنابراین حلالیت آن مناسب­تر است. این پپتید بعداً نیز در حل شدن به PBS کدورت ضعیفی می‌داد. عموماً gravy بالای 5/0- می‌بایست باشد و کمتر از آن حلالیت پپتید پایین است (Gravy هرچه منفی­تر باشد، حلالیت بیشتر است). از‌نظر موقعیت ژنومی، در مقایسه با سوش رفرانس این پپتید در موقعیت آمینواسیدی 865 تا 884، ژنوم ویروس تب برفکی تایپ O و در توالی پروتئینی مابین اسید‌آمینه 161-141: VP1 واقع شده است.

در پپتید 14 آمینواسیدی با‌توجه‌به خصوصیات فیزیکوشیمیایی، pI نسبتاً بالا می­باشد. همچنین به‌دلیل نوع توالی آمینواسید آن در اسپکترفتومتری قابل‌بررسی از‌نظر مقدار نیست. نیمه عمر آن در حالت محلول و بدون نگهدارنده در دمای آزمایشگاه براساس محاسبات بیوانفورماتیکی حدود 2 ساعت می­باشد. پپتید ناپایدار است و امکان تجزیه آن بعد از گذشت این زمان وجود دارد، بنابراین می­بایست به‌صورت پودر باشد و به‌طور مستمر در 20- درجه سانتی‌گراد نگهداری شود. همچنین مدت این نگهداشت کمتر از 1 سال است (مطابق با تست زمان واقعی کنترل کیفی در ارزیابی پایداری فراورده­های بیولوژیک و معادله آرنیوس در کنترل کیفی). شاخص gravy پپتید 14 آمینواسیدی نشان می­دهد این پپتید به‌راحتی در آب‌مقطر ایزوتونیک (pH فیزیولوژیک) حل می­شود و حلالیت آن از پپتید 20 آمینواسیدی بهتر است.

جهت ارزیابی قدرت آنتی‌ژنی و وجود اپی‌توپ­های B cell از نرم‌افزار تحت شبکه با آدرس دسترسی http://tools.iedb.org/main/bcell استفاده شد (20).

نتایج و آنالیزهای بخش سنتز پپتید (خالص‌سازی پپتیدها): پس از انجام کروماتوگرافی مایع با کارایی بالای تهیه­ و خشک شدن با استفاده از فریز درایر، خلوص نمونه­های پپتیدی 14 و 20 آمینواسیدی به‌ترتیب 96 و 98 درصد بودند.

شناسایی توالی­های سنتز‌شده: در طیف جرمی توالی 14 آمینواسیدی، پیک­های شاخص [M+2H]2+/2، [M+3H]3+/3 و [M+4H]4+/4 به‌ترتیب در جرم­های 8/817، 2/545 و 9/408 تأیید‌کننده سنتز نمونه بودند. برای ترکیب با توالی 20 آمینو‌اسیدی نیز پیک­های 1063 و 708 به‌ترتیب نشان‌دهنده جرم­های [M+2H]2+/2، [M+3H]3+/3 بودند.

ارزیابی قدرت آنتی‌ژنی و وجود اپی‌توپ­های B cell: ارزیابی شاخص­های آنتی‌ژنی و وجود اپی‌توپ­های B cell حاکی از آن بود که علی‌رغم کوتاه بودن 2 پپتید سنتز‌شده، می­توانند در القای ایمنی موفق عمل کنند. نکته دیگر اینکه اپی‌توپ­های B cell  در داخل و یا منطبق بر بخش آنتی‌ژنی هر دو توالی بودند. در جدول 2 به نتایج آنالیز این دو شاخص اشاره شده است. میزان آب‌دوستی پپتیدهای سنتز‌شده با نرم‌افزار Bioedit  نسخه 7.0.9.0 بررسی شد که نتایج در تصویر 2 آورده شده است. نواحی‌ای که بیشترین میزان آب‌دوستی را نشان می­دهند، با نواحی آنتی‌ژنیک و اپی‌توپ­های B cell منطبق بودند.

نتایج ایمن‌سازی و بررسی پاسخ ایمنی به پپتیدها با روش الایزای غیرمستقیم: پس از انجام تزریق سوم و تکمیل شدن ایمن‌سازی، خون‌گیری انجام و سرم­ جدا شد. سپس نمونه­ها با اضافه کردن 20 درصد گلیسرول در دمای 70- درجه سانتی‌گراد تا زمان استفاده ذخیره‌سازی شدند. چکر بورد جهت بررسی میزان غلظت مناسب آنتی‌ژن پپتیدی به آنتی‌بادی و سپس کونژوگه نسبت به این دو انجام شد. نتایج نشان‌دهنده ارزش ایمن‌سازی با مقدار 400 میکروگرم پپتید متصل به پروتئین حامل (BSA) در دُز آغازین و 200 میکروگرم در دُزهای یادآور بود. در چکر بورد، غلظت مناسب پپتیدی جهت کوتینگ 300 نانوگرم در هر چاهک برای هر پپتید و غلظت مناسب سرم 1:40 به دست آمد. همچنین کونژوگه نیز با رقت 1:10000 به‌عنوان بهینه­ترین غلظت انتخاب شد.

نقطه جداکننده (Cutt-off) برای تمایز بین سیگنال­های مثبت و منفی 4/0 واحد OD تعیین شد که با استفاده از مقدار متوسط 3 آزمایش مستقل و میانگین 3 نمونه سرم مرجع منفی استاندارد خرگوش، به علاوه 15/0 به دست آمد.

 در ادامه بر روی نمونه­های سرم­های به‌دست‌آمده از اولین روز تزریق (روز صفر) و 7 روز بعد از تزریق سوم خرگوش تست الایزا گذاشته شد. نتایج بیانگر موفقیت ایمن‌سازی و نتایج بهتر ایمنی‌زایی در حیوان مدل، توسط پپتید 20 آمینواسیدی در مقایسه با پپتید 14 آمینواسیدی بود. در جدول 3، ستون 1 تا 5 نتایج پلیت الایزای پوشش داده‌شده با پپتید 20 آمینواسیدی و ستون 7 تا 11 نتایج پپتید 14 آمینواسیدی نشان داده شده است. از سرم خرگوش­های هایپر ایمیون پس از 5 بار تزریق جهت الایزا استفاده شده است. ستون 6 (پپتید 20 آمینواسیدی) و 12 (پپتید 14 آمینواسیدی) سرم­های خرگوش در روز صفر بوده که به‌عنوان کنترل منفی در نظر گرفته شدند. هرچه طول توالی پپتید بیشتر باشد در موفقیت پاسخ ایمنی تأثیر‌گذارتر است و از سوی دیگر اگر این پپتید علاوه‌بر ایمنی‌زایی خواص خنثی‌کنندگی هم داشته باشد، می­تواند در محافظت و خنثی‌سازی علیه ویروس نقش پررنگ­تری ایفا کند و همچنین نتایج بالاتری در تست خنثی‌سازی ویروس نشان دهد.

میانگین کلی OD برای پپتید 20 آمینواسیدی و 14 آمینواسیدی در چاهک­­های پلیت به‌ترتیب 116/1 و 970/0 بوده است. همچنین پپتید 14 آمینواسیدی تفاوت بیشتری در CV در یک سنجش را (The coefficient of variation (CV) Intra-assay) در بین چاهک­ها نسبت به پپتید 20 آمینواسیدی نشان می­دهد. از سوی دیگر، اگر در اتصال پپتیدها به ته چاهک میکروپلیت پلی استیرن از پروتئین BSA به‌عنوان پروتئین پایه­ای نگهدارنده به پلیت استفاده نشود، سیگنال­های به‌دست‌آمده به سبب pH ایزوالکتریک بالای پپتیدها، طول کوتاه توالی آن­ها، پایداری کم و امکان دفن شدن حین بلاکینگ، پایین‌تر از OD‌های 6/0 خواهد بود.

ابتدا آزمون آماری کولموگروف اسمیرنف (Kolmogorov-Smirnov) برای تست نرمالیتی داده­ها انجام شد و از‌آنجا‌که توزیع داده­ها نرمال نبود، از آزمون آماری ناپارامتریک من ویتنی یو (Mann-Whitney U) برای مقایسه مقادیر قبل و بعد و نیز 2 گروه پپتید 20 و پپتید 14 اسید‌آمینه­ای استفاده شد (40 نمونه در گروه پپتید 20 آمینواسیدی، 40 نمونه در گروه پپتید 14 آمینواسیدی بعد از تزریق و 8 نمونه در گروه پپتید 20 آمینواسیدی قبل از تزریق و 8 نمونه نیز در گروه پپتید 14 آمینواسیدی قبل از تزریق تحلیل شدند).

براساس نتیجه آزمون آماری، مقادیر قبل و بعد در هر دو پپتید 20 و 14 اسید‌آمینه­ای با هم تفاوت آماری معنی‎دار دارند و نیز مقادیر OD بعد از تزریق، در پپتید 20 اسیدآمینه‌ای به‌طور معنی‎دار بیشتر است. در‌مورد مقادیر قبل از تزریق، OD تفاوت آماری معنی‎دار ندارد (جدول 4 و تصویر 3).

بحث

یک بخش مجزا از پروتئین آنتی‌ژن می­تواند به‌عنوان یک واکسن زیرواحد مؤثر عمل کند. این بخش کوچک آنتی­ژن پپتید است که از زنجیره­ای کوچک از آمینواسیدها تشکیل شده است و یک اپی­توپ واحد را تشکیل می­دهد. پپتیدهای کوچکی که شامل اپی­توپ­ها می‌باشند، ایمونوژن بوده و می­توانند به‌عنوان واکسن پپتیدی استفاده شوند. به‌عنوان مثال پروتئین- FMDV (VP1)، یک پپتید ایمونوژنیک است که به‌طور شیمیایی سنتز شده و برای ایجاد پاسخ ایمنی مورد آزمایش قرار گرفته است. با‌این‌حال، پپتیدهای خیلی کوچک شامل 15 تا 20 آمینو‌اسید، به اندازه کافی ایمونوژنیک نمی‌باشند و نسبت به پپتیدهای بزرگ‌تر ایمنی­زایی کمتری دارند (15).

واکسن پپتیدی یک واکسن زیرواحدی است که براساس هر پپتیدی که برای ایمن‌سازی ارگانیسم در برابر عامل بیماری­زا عمل می­کند، طراحی می­شود. واکسن­های پپتیدی اغلب سنتزی می‌باشند و پروتئین­های طبیعی موجود در عوامل بیماری‌زا را تقلید می­کنند (21). این واکسن­ها در برانگیختن پاسخ ایمنی بسیار مؤثر و گزینشی عمل می­کنند. علاوه‌بر عوامل بیماری­زا واکسن­های پپتیدی می­توانند به‌عنوان واکسن­های درمانی سرطانی استفاده شوند (22).

در حال حاضر، الایزا یکی از رایج­ترین رویکردها در تشخیص FMDV علاوه بر روش­های جداسازی ویروس، VNT و تکنیک‌های مبتنی بر PCR است. طبق گزارشی از آزمایشگاه مرجع منطقه‌ای برای FMD در آسیای جنوب شرقی، بیش از 13000 الایزا در مقایسه با 304 VNT و 790 سنجش مبتنی بر PCR برای تشخیص FMD در سال 2017 انجام شده است (1، 2، 16).

الایزای رقابتی فاز جامد SPC-ELISA نیز برای تشخیص FMDV توسعه داده شده است. این روش بر‌اساس رقابت بین آنتی‌بادی‎های موجود در سرم­های آزمایش‌شده و آنتی‌بادی­های ضد FMDV خوکچه هندی اختصاصی سروتیپ است (1، 2). Wong و همکاران در سال 2020 با توجه به ارازیابی داده‎های آزمایشگاهی بیان کردند که هر دو LPB-ELISA و SPC-ELISA دارای حساسیت و محدودیت تشخیص مشابهی می‌باشند، اما باوجوداین ویژگی SPC-ELISA بالاتر گزارش شده و یک روش تشخیصی بر‌اساس آنتی‌بادی اختصاصی FMDV بهبود‌یافته را برای غربالگری انبوه (Mass screening) ارائه می­دهد. همچنین Hatem و همکاران در سال 2022 و سایر محققین نشان دادند SPC-ELISA نسبت به VNT برای تشخیص زودهنگام عفونت FMDV در گاو و گوسفند حساس‌تر است (1، 2، 16).

علاوه‌بر‌این، حساسیت SPC-ELISA کمتر تحت‌تأثیر سویه‌های FMDV مورد‌استفاده در سنجش قرار می‌گیرد، در‌حالی‌که حساسیت VNT می‌تواند به‌طور قابل‌توجهی در صورت استفاده از ویروس هترولوگ کاهش یابد.

الایزای رقابتی فاز جامد که کیت­های رایج در ایران و جهان‌ می‌باشند، می‌توانند آنتی‌بادی‌ها علیه 6 سروتیپ غیر (A, C, SAT 1, SAT 2, SAT 3, and Asia 1) FMDV O با ویژگی بین 4/99 تا 9/99 درصد و حساسیت قابل‌مقایسه با LPB-ELISA و VNT را تشخیص دهند (16). اخیراً طی مطالعه‎ای حساسیت کیت SPC-ELISA برای تشخیص اختصاصی سروتیپ O FMDV کمتر بود و نتایج مثبت کاذب بیشتری در مقایسه با LPB-ELISA و VNT ایجاد کرد (1، 2).

در این پروژه مطالعاتی، توالی­های طراحی‌شده پس از بررسی روش­های سنتز بر روی رزین 2-کلروتریتیل کلراید طبق پروتکل فاز جامد سنتز شدند. پس از محافظت‌زدایی زنجیره جانبی توالی­ها، خالص‌سازی توسط کروماتوگرافی انجام و  سپس با استفاده از طیف جرمی، ساختار توالی­های سنتز‌شده بررسی شد. در قدم نهایی برای بررسی توالی­های طراحی‌شده، نمونه­ها پس از فرموله شدن با ادجوانت مناسب، در حیوان مدل تزریق شدند. پس از 3 دوره تزریق با فاصله زمانی 2 هفته در هر تزریق، خون‌گیری انجام و سرم­ها جداسازی شدند. با سرم­های به‌دست‌آمده تست ایمنی‌زایی انجام شد.

نتیجه‌گیری نهایی: نتایج تست الایزا نشان می­دهد این دو پپتید در صورت مطالعات بیشتر می­توانند کاندیدهای مناسبی جهت ارزیابی پاسخ ایمنی علیه ویروس تب برفکی در تست­های سرولوژیک و در حیوانات واکسینه و غیر‌واکسینه یا آلوده به ویروس وحشی باشند. در این میان پپتید 20 آمینواسید نتایج ایمنی‌زایی بهتری را نسبت به پپتید 14 آمینواسیدی در خرگوش نشان داد.

به نظر می­رسد سنتز پپتیدهای انتخابی برداشت‌شده از ناحیه V1 ژنوم ویروس که مسئول سنتز کل کپسید می‌باشد، قدرت ایمنی‌زایی مؤثر در حیوان آزمایشگاهی داشته و همچنین این ایمنی واکنش متقاطع با ویروس کامل دارد. این پپتید در ادامه قادر به استفاده جهت توسعه کیت­های الایزا پپتیدی می­باشد. مطالعات صورت‌گرفته حاکی از آن است که کوتاه بودن پپتیدهای سنتزی ممکن است شکل فضایی منطبق با نواحی متناظر با ویروس کامل را ایجاد نکند و از سوی دیگر سبب سرعت تخریب سریع­تر آن شود. احتمالاً این موضوع اثر نامطلوبی بر قدرت ایمنی‌زای پپتیدها در حیوان خواهد داشت. بنابراین پیشنهاد می­شود از پپتیدهای بالای 20 آمینواسید با ارزیابی میزان پاسخ ایمنی، حفظ کانفورمیشن فضایی و مهندسی ساخت با بهینه‌سازی خواص فیزیکوشیمیایی برای فرمولاسیون مؤثرتر و همچنین استفاده در ساخت کیت و امکان کونژوگاسیون بعدی استفاده شود. همه این داده­ها نشان می­دهد پپتیدها قادر به تحریک سیستم ایمنی در خرگوش بوده و کیت­های الایزای پپتیدی تهیه‌شده حاصل از آن­ها که در مطالعه حاضر تولید شده است، می­توانند به‌عنوان یک ابزار نظارت سرولوژیکی سریع و قابل‌اعتماد برای نظارت بر عفونت یا سطح ایمن‌سازی پس از واکسیناسیون باشد.

سپاسگزاری

نویسندگان از معاونت پژوهشی مؤسسه تحقیقات واکسن و سرم‌سازی رازی جهت حمایت مالی از مطالعه حاضر تشکر و قدردانی می‌کنند.

تعارض منافع

بین نویسندگان تعارض در منافع گزارش نشده است.

  1. Abd Hatem A, Ahmed Abdul Wahid Al Anbagi N, Al-Alo KZK, Sabah Bustani G. Detection of clinical and subclinical foot and mouth disease virus in cattle in Al-Najaf Province. Arch Razi Inst. 2022;77(3):1185-1189. doi: 10.22092/ARI.2022.357621.2074 PMID: 36618320
  2. Wong CL, Yong CY, Ong HK, Ho KL, Tan WS. Advances in the diagnosis of foot-and-mouth disease. Front Vet Sci. 2020;7:477. doi: 10.3389/fvets.2020.00477 PMID: 32974392
  3. Perry BD, Rich KM. Poverty impacts of food-and-mouth disease and the poverty reduction implications of its control. Vet Rec. 2007;60:238-241. doi: 10.1136/vr.160.7.238 PMID: 17308024
  4. Ashir Zia1 M, Dobson SJ, Rowlands DJ, Stonehouse NJ, Salahuddin Shah M, Habib M. Development of an ELISA to distinguish between foot-and-mouth disease virus infected and vaccinated animals utilising the viral non-structural protein 3ABC. J Med Microbiol. 2022;71:001516. doi: 10.1099/jmm.0.001516
  5. Knowles NJ, Samuel AR. Moleular epidemiology of foot-and- mouth disease virus. Vinus Res. 2003;91:65-80. doi: 10.1016/s0168-1702(02)00260-5 PMID: 12527438
  6. Rodriguez LL, Gay CG. Dvelopment of vaccines to ward the global control and evadiation of food-and-mouth disease. Expert Rev Vaccine. 2011;10:377-387. doi: 10.1586/erv.11.4 PMID: 21434805
  7. Zibaei M, Kianizadeh M, Keivanfar H, Rabani M, Hematzadeh F, Bokaei S. Identification of the foot and mouth disease foci from susceptible foci in khorasan razavi, province. J Vet Res. 2007;62:151-55.
  8. Forner M, Cañas-Arranz R, Defaus S, de León P, Rodríguez-Pulido M, Ganges L, et al. Peptide-based vaccines: foot-and-mouth disease virus, a paradigm in animal health. Vaccines (Basel). 2021;9(5):477. doi: 10.3390/vaccines9050477 PMID: 34066901
  9. Nardin E, Calvo-Calle J, Oliveira G, Nussenzweig R, Schneider M, Tiercy J, et al. A totally synthetic polyoxime malaria vaccine containing plasmodium falciparum B cell and universal T cell epitopes elicits immune response in volunteers of diverse HLA J Immunol. 2001;166:481-489. doi: 10.4049/jimmunol.166.1.481 PMID: 11123327
  10. Guo H, Song Y, Li H, Hu H, Shi Y, Jiang J, Guo J, Cao L, Mao N, Zhang Y. A mixture of t-cell epitope peptides derived from human respiratory syncytial virus F protein conferred protection in DR1-TCR Tg mice. Vaccines. 2024;12(1):77. doi: 10.3390/vaccines12010077
  11. Muhanguzi D, Ndekezi C, Nkamwesiga J, Kalayou S, Ochwo S, Vuyani M, et al. Anti-tick vaccines: Current advances and future prospects. Methods Mol Biol. 2022;2411:253-267. doi: 10.1007/978-1-0716-1888-2_15 PMID: 34816410
  12. Yang H, Kim DS. Peptide immunotherapy in vaccine development: From epitope to adjuvant. Adv Protein Chem Struct Biol. 2015;99:1-14. doi: 10.1016/bs.apcsb.2015.03.001 PMID: 26067814
  13. Kaushik S, Kumari L, Deepak RK. Humanized mouse model for vaccine evaluation: an overview. Clin Exp Vaccine Res. 2024;13(1):10-20. doi: 10.7774/cevr.2024.13.1.10 PMID: 38362371
  14. Pilon JL, Rhyan JC, Wolfe LL, Davis TR, McCollum MP, O'Rourke KI, et al. Immunization with a synthetic peptide vaccine fails to protect mule deer (Odocoileus hemionus) from chronic wasting disease. J Wildl Dis. 2013;49(3):694-8. doi: 10.7589/2012-07-200 PMID: 23778624
  15. Malonis RJ, Lai JR, Vergnolle O. Peptide-based vaccines: Current progress and future challenges. Chem Rev. 2020;120(6):3210-3229. doi: 10.1021/acs.chemrev.9b00472 PMID: 31804810
  16. Ivani Z, Ranjbar MM., Hemati B, Harzandi N, azimi SM. Evaluation of specific chicken IgY antibody value developing diagnostic capture antibody ELISA kit against Foot and Mouth disease. Arch Razi Inst. 2024;79(1):201-210. doi: 10.32592/ARI.2024.79.1.201
  17. Ochoa WF, Kalko SG, Mateu MG, Gomes P, Andreu D, Domingo E, et al. A multiply substituted G-H loop from foot-and-mouth disease virus in complex with a neutralizing antibody: a role for water molecules. J Gen Virol. 2000;81(Pt 6):1495-505. doi: 10.1099/0022-1317-81-6-1495 PMID: 10811933
  18. Wang G, Liu Y, Feng H, Chen Y, Yang S, Wei Q, et al. Immunogenicity evaluation of MS2 phage-mediated chimeric nanoparticle displaying an immunodominant B cell epitope of foot-and-mouth disease virus. Peer 2018;6:e4823. doi: 10.7717/peerj.4823
  19. Azimi SM, Mahravani H, Lotfi M. Genetic and antigenic evaluation of foot-and-mouth disease virus type a in the endemic area of iran within 2014-2015. Arch Razi Inst. 2020;75:349-357. doi: 10.22092/ari.2019.123610.1287
  20. Jespersen MC, Peters B, Nielsen M, Marcatili P. Bepipred linear epitope prediction 2.0. 2017. BepiPred-2.0: improving sequence-based B-cell epitope prediction using conformational epitopes. Nucleic Acids Res (Web Server issue). 2:2.
  21. Nelde A, Rammensee HG, Walz JS. The peptide vaccine of the future. Mol Cell Proteomics. 2021;20:100022. doi: 10.1074/mcp.R120.002309 PMID: 33583769
  22. Melief CJ, van der Burg SH. Immunotherapy of established (pre)malignant disease by synthetic long peptide vaccines. Nat Rev Cancer. 2008;8(5):351-60. doi: 10.1038/nrc2373 PMID: 18418403