مقدمه

بیماری ورم پستان گاو یکی از پرهزینه‌ترین و پیچیده‌ترین بیماری‌ها در صنایع لبنی محسوب‌‌ می‌شود. پیچیدگی بیماری مرتبط با تعدد باکتری‌های ‌‌بیماری‌زای عامل ایجاد بیماری، واکنش‌های فیزیولوژیکی متفاوت و مختلف نسبت به عوامل ‌‌بیماری‌زا و همچنین تفاوت در تأثیر اقدامات پیشگیرانه و کنترلی برای ارگانیسم‌های مختلف‌‌ می‌باشد (1). سویه‌های استافیلوکوکوس اورئوس (Staphylococcus aureus)‌‌ به‌عنوان ‌‌بیماری‌زاهای اصلی در میان گاوهای شیرده شناخته‌‌ می‌شوند که باعث کاهش قابل‌توجه تولید شیر و ایجاد خسارات جبران‌ناپذیر در صنایع لبنی شده و‌‌ به‌عنوان یک عامل ایجاد خطر برای سلامت عمومی جامعه محسوب‌‌ می‌شوند (2، 3). اعضای این جنس بر‌اساس توانایی یا عدم توانایی آن‌ها در ایجاد لخته از پلاسمای سیتراته خرگوش، به دو دسته کواگولاز مثبت و کواگولاز منفی تقسیم‌بندی‌‌ می‌شوند که‌‌ به‌عنوان یک آزمون کلیدی تشخیصی مهم در میکروب‌شناسی بالینی شناخته‌‌ می‌شود (4). گونه‌های کواگولاز منفی جنس استافیلوکوکوس پیش‌تر از‌نظر ‌‌بیماری‌زایی چندان حائز اهمیت نبودند و تنها گزارشاتی از نقش آن‌ها در موارد تحت بالینی ورم پستان دام در اختیار بود.

 با وجود این، شواهد متعددی نشان‌‌ می‌دهند گونه‌های کواگولاز منفی استافیلوکوکوس (Coagulase negative Staphylococcus (CoNS)) از عفونت‌های ورم پستان جداسازی شده‌اند و بنابراین‌‌ به‌عنوان ‌‌بیماری‌زاهای نوظهور جهت ایجاد عفونت‌های پستانی گاو در نظر گرفته‌‌ می‌شوند (1، 5). شایع‌ترین گونه‌های استافیلوکوکوس کواگولاز منفی جداسازی‌شده از عفونت‌های داخلی پستان دام شامل استافیلوکوکوس کروموژنز (Staphylococcus chromogens)، استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس (Staphylococcus epidermidis)، استافیلوکوکوس همولیتیکوس (Staphylococcus haemolyticus)، استافیلوکوکوس سیوری (Staphylococcus sciuri)، استافیلوکوکوس سیمولانس (Staphylococcus simulans)، استافیلوکوکوس کوهنی (Staphylococcus cohnii)، استافیلوکوکوس زایلوزوز (Staphylococcus xylosus)، استافیلوکوکوس وارنری (Staphylococcus warneri)، استافیلوکوکوس کپتیس (Staphylococcus captis) و استافیلوکوکوس ایکوروم (Staphylococcus equorum)‌‌ می‌باشند (5-7). عوامل حدت مختلفی، مانند‌‌ ژن‌های انتروتوکسینی (sea-seq)، ژن توکسین سندرم شوک سمی (Toxic shock syndrome toxin-1 (TSST-1))، عامل لخته (Clumping factor (CLF)) (clfA-clfD)، ژن چسبندگی بین‌سلولی و تشکیل بیوفیلم (icaA-icaD)، ژن توکسین همولیزین (hla، hlb، hld و hlg)، ژن لوکوسیدین پنتون ـ ولنتاین و‌‌ ژن‌های مقاومت ‌‌آنتی‌بیوتیکی (mecA و mecC) که در ابتدا در استافیلوکوکوس اورئوس شناسایی شدند، در حال حاضر در سویه‌های کواگولاز منفی استافیلوکوکوس نیز مورد شناسایی قرار گرفته‌اند. این عوامل حدت مسئول کلونیزاسیون و ایجاد بیماری در غدد پستانی دام‌ها و همچنین ایجاد مسمومیت‌های غذایی‌‌ می‌باشند (5-11).

از دیرباز گزارش‌های متعددی در‌مورد نقش استافیلوکوکوس اورئوس‌‌ به‌عنوان عامل ‌‌بیماری‌زایی و ایجاد بیماری ورم پستان دام و ایجاد مسمومیت غذایی در اختیار بوده است (12-14)، با‌این‌حال اطلاعات چندانی در‌مورد عوامل حدت گونه‌های مختلف کواگولاز منفی این جنس برای ایجاد عفونت پستان و مسمومیت غذایی در سطح جهانی منتشر نشده است (5، 6). در سال‌های اخیر عدم کفایت آزمون‌های بیوشیمیایی جهت شناسایی دقیق گونه‌های کواگولاز منفی در عفونت‌های ورم پستان دام مشخص شده است؛ بنابراین استفاده از آزمون‌های مولکولی با استفاده از پرایمرهای اختصاصی جهت شناسایی دقیق و سریع این گونه‌‌ها توصیه‌‌ می‌شوند (6، 15). علاوه‌بر‌این، در ایران نیز اطلاعات جامعی در‌مورد میزان شیوع و فراوانی گونه‌های مختلف کواگولاز منفی استافیلوکوکوس و همچنین الگوی مقاومت ‌‌آنتی‌بیوتیکی، انواع عوامل حدت و انتشار کلونال این گونه‌‌ها در بالین و در میان دام‌ها وجود ندارد؛ بنابراین مطالعه حاضر با هدف تعیین فراوانی، الگوی مقاومت ‌‌آنتی‌بیوتیکی و‌‌ ژن‌های مربوط به عوامل حدت در میان‌‌ گونه‌های مختلف استافیلوکوک‌های کواگولاز منفی جداسازی‌شده از نمونه‌های شیر گاوهای مبتلا به بیماری ورم پستان در شهر کرج در سال 1402 انجام گرفت.

مواد و روش کار

نمونه‌گیری، جمع‌آوری و شناسایی ایزوله‌های استافیلوکوکوس: در مطالعه حاضر که به‌صورت مقطعی انجام شد از خرداد لغایت آبان سال 1402 نمونه‌گیری از سه دامداری در حومه شهر کرج انجام گرفت. تمام دامداری‌های مورد‌مطالعه از نوع نیمه‌صنعتی بوده و تحت نظارت مستمر دامپزشکی فعالیت داشتند. فرایند شیردوشی گاوها روزانه 2 بار با دستگاه انجام ‌شد. مدیریت بهداشتی در این مراکز شامل اجرای برنامه‌های منظم واکسیناسیون، پایش سلامت دام‌ها، رعایت اصول بهداشتی در فرایند شیردوشی و درمان موارد ابتلا به ورم پستان طبق پروتکل‌های استاندارد ملی صورت ‌گرفت. ثبت داده‌های مرتبط با تولید شیر و وضعیت سلامت هر دام به‌صورت منظم انجام ‌شد. تغذیه دام‌ها بر پایه کنسانتره و علوفه تازه بود. در‌مجموع 318 گاو مبتلا به ورم پستان انتخاب شدند (دامداری 1: 144 گاو (45 درصد)، دامداری 2: 95 گاو (30 درصد) و دامداری 3: 79 گاو (25 درصد)) و نمونه‌گیری از هر دام به‌صورت جداگانه توسط پرسنل هر دامداری انجام گرفت. انتخاب حیوانات‌‌ بر‌اساس ویزیت دام توسط دامپزشک و وجود علائمی از قبیل التهاب در ناحیه پستان و همچنین بررسی نمونه شیر هر دام از‌نظر وجود لخته یا تغییر رنگ شیر صورت گرفت. ‌‌نمونه‌گیری با استفاده از بطری‌های 250 میلی‌لیتری درب آبی استریل انجام شد و برای این منظور ابتدا سه مرتبه شیر از پستان دام خارج شد و سپس در مرتبه چهارم در حدود 50 میلی‌لیتر نمونه شیر جمع‌آوری شد. نمونه‌ها پس از جمع‌آوری در کنار یخ و رعایت زنجیره سرد به آزمایشگاه ارسال شدند. در آزمایشگاه باکتری‌شناسی دانشگاه اصفهان، در ابتدا نمونه‌های شیر بر روی محیط ژلوز مانیتول سالت (Merck, Darmstadt, Germany) کشت داده شدند و پلیت‌ها به‌مدت 48 ساعت در دمای 37 درجه ‌‌سانتی‌گراد انکوبه شدند. پس از این مدت، کلنی‌های سفید یا صورتی‌رنگ‌‌ به‌عنوان ایزوله‌‌های مشکوک به استافیلوکوکوس یا میکروکوکوس انتخاب شدند و پس از کشت و خالص‌سازی بر روی محیط ژلوز کلمبیا (Merck, Darmstadt, Germany) از آزمون‌های کاتالاز و اکسیداز و همچنین رنگ‌آمیزی گرم جهت افتراق استافیلوکوکوس و میکروکوکوس از یکدیگر استفاده گردید (4). در‌نهایت تمام ایزوله‌هایی که کوکسی گرم مثبت کاتالاز مثبت و اکسیداز منفی بودند‌‌ جمع‌آوری شدند و با استفاده از آزمون کواگولاز به روش لوله (4) ایزوله‌های کواگولاز منفی انتخاب شدند و در محیط مغذی واجد 50 درصد گلیسرول در فریزر با دمای 20- درجه ‌‌سانتی‌گراد ذخیره شدند. همچنین با‌توجه‌به اینکه استافیلوکوکوس سیوری اکسیداز مثبت است، نحوه آرایش و اندازه کوکسی‌های گرم مثبت جهت افتراق دو جنس از یکدیگر از اهمیت بالاتری برخوردار بود. سپس از هر ایزوله کواگولاز منفی بر روی محیط‌های ژلوز خون‌دار (Scharlau, Spain) و ژلوز مانیتول سالت (Merck, Darmstadt, Germany) کشت داده شد و همچنین از آزمون‌های تولید آنزیم اوره آز و تخمیر قندهای مالتوز و سوکروز نیز جهت افتراق گونه‌‌های مختلف ایزوله‌های کواگولاز منفی استافیلوکوکوس استفاده شد (4). پس از شناسایی گونه‌های مختلف با استفاده از آزمون‌های بیوشیمیایی، از آزمون polymerase chain reaction (PCR) و پرایمرهای اختصاصی جهت تأیید هر گونه استفاده شد. ℃

تعیین مقاومت ‌‌آنتی‌بیوتیکی: پس از شناسایی و تأیید هر سویه جداسازی‌شده، مقاومت ‌‌آنتی‌بیوتیکی آن‌ها نسبت به ‌‌آنتی‌بیوتیک‌های مختلف به روش انتشار دیسک و‌‌ بر‌اساس دستورالعمل‌های clinical and laboratory standards institute (CLSI) تعیین گردید (16). دیسک‌های مورد‌استفاده (Liofilchem, Italy) شامل اریترومایسین (15 میکروگرم)، اگزاسیلین (1 میکروگرم)، پنی‌سیلین (10 واحد)، تتراسایکلین (30 میکروگرم)، تری متوپریم ـ سولفامتوکسازول (25/1-75/23 میکروگرم)، جنتامایسین (10 میکروگرم)، ریفامپین (5 میکروگرم)، سیپروفلوکساسین (5 میکروگرم)، کلرامفنیکل (30 میکروگرم)، کلیندامایسین (2 میکروگرم)، لینزولاید (30 میکروگرم)، مینوسایکلین (15 میکروگرم) و نیتروفورانتوئین (300 میکروگرم) بودند. همچنین برای تعیین مقاومت ‌‌آنتی‌بیوتیکی سویه‌‌ها نسبت به ونکومایسین از آزمون حداقل غلظت ممانعت‌کننده از رشد ‌‌آنتی‌بیوتیک و به روش broth microdilution و‌‌ بر‌اساس استانداردهای CLSI استفاده شد (R ≥ 32 µg/mL, I = 8-16 µg/mL) (16). علاوه‌بر‌این سویه‌هایی که نسبت به حداقل 3 ‌‌آنتی‌بیوتیک از خانواده‌های مختلف ‌‌آنتی‌بیوتیکی مقاومت نشان دادند‌‌ به‌عنوان سویه‌هایی با مقاومت چندگانه در نظر گرفته شدند.

آزمون‌های مولکولی (استخراج DNA باکتریایی): برای استخراج DNA از هر ایزوله باکتریایی از روش جوشاندن‌‌ بر‌اساس پروتکل پیشین Rahimi و همکاران در سال 2024 استفاده شد (17). بر‌این‌اساس یک لوپ پر از باکتری در 200 میکرولیتر آب‌مقطر استریل در یک میکروتیوب 5/1 میکرولیتر به‌خوبی مخلوط و ورتکس شد و سپس سوسپانسیون حاصل در دستگاه ترموبلاک (HPN-24، پدیده نوژن پارس) در دمای 100 درجه ‌‌سانتی‌گراد به‌مدت 20 دقیقه جوشانده شد. پس از این مدت، میکروتیوب‌ها در دستگاه سانتریفیوژ یخچال‌دار (ARM-500، ارمغان طب ایرانیان) به‌مدت 20 دقیقه در g × 14000 سانتریفیوژ شدند و در‌نهایت 10 میکرولیتر از مایع رویی هر میکروتیوب‌‌ به‌عنوان DNA الگو برای انجام آزمون‌های مختلف PCR مورد استفاده قرار گرفت. DNA استخراج‌شده در فریزر یا یخچال نگهداری نشده و استخراج DNA جهت انجام هر واکنش PCR به‌صورت روزانه انجام گرفت.

شناسایی سویه‌های مختلف: به دنبال استفاده از آزمون‌های بیوشیمیایی جهت شناسایی اولیه ایزوله‌های کواگولاز منفی استافیلوکوکوس، تمام ایزوله‌ها با استفاده از آزمون PCR و پرایمرهای اختصاصی (جدول 1)‌‌ بر‌اساس چرخه حرارتی و شرایطی که پیش‌تر در مطالعات اشاره شده است، مورد تأیید قرار گرفتند (18، 19).

بررسی حضور ژن‌های mecA و mecC در میان سویه‌های استافیلوکوکوس مقاوم به متی‌سیلین: پس از تعیین مقاومت سویه‌های مختلف نسبت به ‌‌آنتی‌بیوتیک سفوکسی تین و انتخاب سویه‌‌های مقاوم به متی‌سیلین، جهت شناسایی‌‌ ژن‌های mecA و mecC، در میان این سویه‌‌ها از دو آزمون PCR جداگانه و پرایمرهای اختصاصی هر ژن (جدول 1)‌‌ بر‌اساس دستورالعمل‌های پیشین استفاده شد (20، 21).

تعیین حضور‌‌ ژن‌های مربوط به عوامل حدت در میان سویه‌ها: جهت بررسی حضور‌‌ ژن‌های مربوط به توکسین‌های SEA-SEQ در میان سویه‌ها از دو آزمون multiplex-PCR جداگانه با استفاده از پرایمرهای اختصاصی هر ژن انتروتوکسینی‌‌ بر‌اساس دستورالعمل Rahimi و همکاران در سال 2019 استفاده شد (22). همچنین برای تعیین فراوانی‌‌ ژن‌های pvl، tst (23) و همولیزین‌ها (β، α و γ) (5) نیز از آزمون‌های PCR مختلف استفاده شد.

تجزیه‌و‌تحلیل داده‌ها: در مطالعه حاضر به‌منظور تجزیه‌و‌تحلیل داده‌های حاصل از آزمون Chi-Square و نرم‌افزار GraphPad Prism 8 استفاده شد.

نتایج

جداسازی و شناسایی سویه‌‌های استافیلوکوکوس کواگولاز منفی: در مطالعه حاضر در‌مجموع 318 گاو شیرده از سه دامداری مختلف در حومه شهر کرج انتخاب شدند و در‌نهایت 125 ایزوله (39 درصد) استافیلوکوکوس کواگولاز منفی از نمونه‌های شیر دام‌های انتخابی جداسازی شد که با استفاده از آزمون‌های بیوشیمیایی و PCR مورد شناسایی و تأیید قرار گرفتند. فراوانی هریک از گونه‌های مربوط به استافیلوکوک‌های کواگولاز منفی در تصویر 1 آورده شده است. بر‌این‌اساس مشخص شد بیشترین فراوانی در نمونه شیرهای آلوده متعلق به استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس است (39 درصد) و پس از آن گونه‌‌های استافیلوکوکوس سیوری (16 درصد)، استافیلوکوکوس سیمولانس (11 درصد) و استافیلوکوکوس وارنری (10 درصد) از بیشترین فراوانی برخوردار بودند. همچنین کمترین فراوانی نیز به‌ترتیب متعلق به استافیلوکوکوس کپیتیس (7 درصد)، استافیلوکوکوس کروموژنز (8 درصد) و استافیلوکوکوس همولیتیکوس (9 درصد) بود. ازطرف‌دیگر، فراوانی هر گونه در سه دامداری مورد‌بررسی نیز در تصویر 2 نشان داده شده است. از مجموع 125 سویه جداسازی‌شده، به‌ترتیب 59 (2/47 درصد)، 38 (4/30 درصد) و 28 (4/22 درصد) سویه از دامداری‌های شماره 3، 1 و 2 جداسازی شدند. همچنین تمام 7 گونه شناسایی‌شده در مطالعه حاضر در دامداری‌های شماره 1 و 3 حاضر بودند، اما دو گونه استافیلوکوکوس سیمولانس و استافیلوکوکوس کروموژنز در نمونه‌های شیر مربوط به دامداری شماره 2 شناسایی نشدند. ازطرف‌دیگر، در دامداری‌های شماره 1 و 3 بیشترین فراوانی به‌ترتیب متعلق به گونه‌های اپیدرمیدیس، سیمولانس و سیوری و در دامداری شماره 2 این فراوانی به‌ترتیب مربوط به گونه‌های اپیدرمیدیس، وارنری و سیوری بود.

بررسی مقاومت ‌‌آنتی‌بیوتیکی سویه‌ها:‌‌ بر‌اساس نتایج حاصل از آزمون تعیین مقاومت ‌‌آنتی‌بیوتیکی سویه‌های متعلق به 7 گونه مورد‌شناسایی در مطالعه حاضر مشخص شد که از مجموع 125 سویه جداسازی‌شده، 69 سویه (55 درصد) نسبت به اگزاسیلین مقاومت نشان دادند و‌‌ به‌عنوان سویه‌های استافیلوکوکوس کواگولاز منفی مقاوم به‌‌ متی‌سیلین انتخاب شدند (تصویر 3). بیشترین فراوانی گونه‌های مقاوم به‌‌ متی‌سیلین به‌ترتیب مربوط به استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس (67 درصد)، استافیلوکوکوس سیوری (10 درصد) و استافیلوکوکوس سیمولانس (7 درصد) بود. همچنین مقاومت کلی سویه‌‌ها نسبت به ‌‌آنتی‌بیوتیک‌های اریترومایسین، پنی‌سیلین، تتراسایکلین، تری متوپریم ـ سولفامتوکسازول، جنتامایسین، ریفامپین، سیپروفلوکساسین، کلرامفنیکل، کلیندامایسین، لینزولاید، مینوسایکلین، نیتروفورانتوئین و ونکومایسین نیز به‌ترتیب 79، 84، 71، 65، 48، 39، 77، 0، 61، 0، 43، 29 و 0 درصد بود (جدول 2). در میان سویه‌های مقاوم به متی‌سیلین، به‌ترتیب 100، 94، 94، 87، 87 و 80 درصد سویه‌‌‌ها به‌ترتیب نسبت به پنی‌سیلین، اریترومایسین، سیپروفلوکساسین، تتراسایکلین، کلیندامایسین و تری متوپریم ـ سولفامتوکسازول مقاوم بودند، اما 64، 61، 55، 52 و 46 درصد سویه‌های حساس به‌‌ متی‌سیلین به‌ترتیب مقاوم به پنی‌سیلین، اریترومایسین، سیپروفلوکساسین، تتراسایکلین و تری متوپریم ـ سولفامتوکسازول بودند.

همچنین تمام سویه‌های حساس و مقاوم به‌‌ متی‌سیلین نسبت به ونکومایسین، لینزولاید و کلرامفنیکل حساس بودند. علاوه‌بر‌این در مقایسه سویه‌‌های حساس به‌‌ متی‌سیلین نسبت به سویه‌های مقاوم به متی‌سیلین، اختلاف معنی‌داری در مقاومت به تمام ‌‌آنتی‌بیوتیک‌ها (0001/0P<)، مشاهده شد. علاوه‌بر‌این، مقاومت ‌‌آنتی‌بیوتیکی هر گونه نسبت به ‌‌آنتی‌بیوتیک‌های مورد‌استفاده به تفکیک نیز در جدول 3 مشخص شده است که دراین‌میان استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس از مقاومت بالاتری نسبت به سایر گونه‌‌‌ها برخوردار بود و پس از آن گونه‌های سیوری و وارنری در مراتب بعدی قرار داشتند.

ازطرف‌دیگر،‌‌ بر‌اساس نتایج حاصل از تعیین مقاومت ‌‌آنتی‌بیوتیکی هر 7 گونه مقاوم به‌‌ متی‌سیلین نسبت به ‌‌آنتی‌بیوتیک‌های مورد‌استفاده (جدول 4) مشخص شد تمام گونه‌‌ها نسبت به پنی‌سیلین مقاوم بودند و استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس بالاترین میزان مقاومت نسبت به سایر ‌‌آنتی‌بیوتیک‌ها را نشان داد و گونه کروموژنز کاملاً نسبت به ‌‌آنتی‌بیوتیک‌های جنتامایسین، تتراسایکلین، نیتروفورانتوئین و مینوسایکلین حساسیت نشان داد. همچنین بیشترین مقاومت نسبت به ‌‌آنتی‌بیوتیک‌های اریترومایسین متعلق به گونه‌های اپیدرمیدیس (100 درصد)، کروموژنز (100 درصد) و سیوری (100 درصد)، سیپروفلوکساسین مربوط به گونه‌‌های اپیدرمیدیس (100 درصد)، همولیتیکوس (100 درصد)، سیوری (100 درصد) و وارنری (100 درصد) و تتراسایکلین مربوط به گونه‌های اپیدرمیدیس (94 درصد)، سیوری (86 درصد) و وارنری (75 درصد) بود.

 در میان گونه‌های مختلف، به‌ترتیب 98، 67، 65، 64، 63، 60 و 56 درصد سویه‌‌های استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس، استافیلوکوکوس وارنری، استافیلوکوکوس سیوری، استافیلوکوکوس سیمولانس، استافیلوکوکوس همولیتیکوس، استافیلوکوکوس کروموژنز و استافیلوکوکوس کپیتیس واجد مقاومت چندگانه بودند. در سویه‌های مقاوم به‌‌ متی‌سیلین نیز مقاومت چندگانه در میان گونه‌های استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس، استافیلوکوکوس سیوری، استافیلوکوکوس سیمولانس، استافیلوکوکوس وارنری، استافیلوکوکوس همولیتیکوس، استافیلوکوکوس کروموژنز و استافیلوکوکوس کپیتیس محدود به 100، 86، 80، 75، 63، 60 و 56 درصد سویه‌‌‌ها بود.

تعیین‌‌ ژن‌های مربوط به عوامل حدت: در مطالعه حاضر تمام 69 سویه استافیلوکوکوس کواگولاز منفی مقاوم به‌‌ متی‌سیلین واجد ژن mecA بودند و ژن mecC در هیچ‌کدام از سویه‌‌ها شناسایی نشد. همچنین از میان تمام‌‌ ژن‌های مربوط به عوامل حدت مورد‌بررسی،‌‌ ژن‌های انتروتوکسین‌های sea، sec، seg، seh، sek، sem، sen، seo، sep و seq (مربوط به ایجاد مسمومیت غذایی) و همچنین‌‌ ژن‌های hla، hlb و pvl در میان سویه‌‌ها شناسایی شدند (جدول 5 و تصویر 4). بر‌این‌اساس، بیشترین فراوانی مربوط به‌‌ ژن‌های sea (36 درصد)، seq (36 درصد) و sek (34 درصد) بود. همچنین، 17، 13، 10، 10 و 10 درصد سویه‌‌‌ها به‌ترتیب واجد‌‌ ژن‌های seg، hlb، hla، sec و sem بودند. استافیلوکوکوس کروموژنز واجد کمترین تعداد‌‌ ژن‌های مربوط به عوامل حدت (5 ژن) بود و در مقابل بیشترین تعداد‌‌ ژن‌های عوامل حدت نیز در گونه‌های سیوری، اپیدرمیدیس و سیمولانسس (11 ژن) شناسایی شد.

بحث

ورم پستان یکی از مهم‌ترین بیماری‌های اقتصادی گاوهای شیری در ایران و بسیاری از کشورهای جهان محسوب‌‌ می‌شود. شناسایی عامل ایجاد بیماری و همچنین اتخاذ پروتکل‌های درمانی مناسب همواره یک چالش بزرگ برای دامپزشکان و کشاورزان بوده است (1)؛ بنابراین انجام مطالعات دقیق و جامع در تمام کشورها با هدف آگاهی از شیوع باکتری‌های مختلف، تعیین انتشار کلونال، عوامل حدت و الگوی مقاومت ‌‌آنتی‌بیوتیکی آن‌ها جهت انتخاب ‌‌آنتی‌بیوتیک مناسب برای درمان و همچنین آگاهی از همه‌گیری و انتشار عفونت‌های داخل‌پستانی کاملاً ضروری به نظر‌‌ می‌رسد. در مقایسه با عفونت‌های ناشی از استافیلوکوک‌های کواگولاز مثبت، استافیلوکوک‌های کواگولاز منفی‌‌ به‌عنوان عوامل نوظهور شیوع عفونت ورم پستان دام در ایران محسوب‌‌ می‌شوند که اطلاعات اندکی نیز از فراوانی گونه‌‌‌های مختلف استافیلوکوکوس کواگولاز منفی در اختیار‌‌ می‌باشد. در مطالعه حاضر 39 درصد شیرهای مورد‌بررسی (125 نمونه از 318 نمونه شیر‌‌ جمع‌آوری‌شده) آلوده به گونه‌های مختلف استافیلوکوکوس کواگولاز منفی بودند که در مقایسه با مطالعه Ebrahimi و همکاران در سال 2014 در شهرکرد (40 درصد) (24) از شیوع نسبتاً برابری برخوردار‌‌ می‌باشند. در مطالعه‌ای در قم در سال 2012 شیوع سویه‌های کواگولاز منفی استافیلوکوکوس 82/13 درصد گزارش گردید (25) که بسیار پایین‌تر از مطالعه حاضر است. در اتیوپی در سال 2024 شیوع استافیلوکوک‌های کواگولاز منفی 6/28 درصد (5) و در هند نیز در سال 2022 این فراوانی 60 درصد گزارش گردید (6). به‌طور‌کلی فراوانی جدایه‌های باکتریایی از نمونه‌های عفونت‌های ورم پستان و همچنین نمونه‌های شیر تحت تأثیر عواملی مانند شیوه‌های مختلف بهداشتی و مدیریتی و همچنین اتخاذ تصمیمات پیشگیرانه در هر دامداری یا مزرعه پرورش دام، سن و نژاد دام‌ها و همچنین سیستم‌های سنتی یا صنعتی مورد‌استفاده برای شیردوشی دام قرار دارد.

در مطالعه حاضر، در‌مجموع 7 گونه مختلف استافیلوکوکوس کواگولاز منفی شامل استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس (39 درصد)، استافیلوکوکوس سیوری (16 درصد)، استافیلوکوکوس سیمولانس (11 درصد)، استافیلوکوکوس وارنری (10 درصد)، استافیلوکوکوس همولیتیکوس (9 درصد)، استافیلوکوکوس کروموژنز (8 درصد) و استافیلوکوکوس کپیتیس (7 درصد) با استفاده از آزمون‌های بیوشیمیایی و مولکولی با پرایمرهای اختصاصی مورد شناسایی و تأیید قرار گرفت. در مطالعه‌ای در سال 2014 در شهرکرد، هیچ‌کدام از استافیلوکوک‌های کواگولاز منفی در حد گونه شناسایی نشدند (24). در هندوستان در سال 2022 نیز با استفاده از آزمون‌های بیوشیمیایی گونه‌های استافیلوکوکوس کوهنی، استافیلوکوکوس سیمولانس، استافیلوکوکوس کپیتیس، استافیلوکوکوس زایلوزوز و استافیلوکوکوس لوگدوننسیس (Staphylococcus lugdunensis) و با استفاده از آزمون‌های مولکولی گونه‌‌های استافیلوکوکوس شلیفری (Staphylococcus schleiferi)، استافیلوکوکوس همولیتیکوس، استافیلوکوکوس سیوری و استافیلوکوکوس کروموژنز از نمونه‌های مربوط به ورم پستان دام شناسایی شدند (6). همچنین در مطالعه دیگری در اتیوپی در سال 2024، 8 گونه استافیلوکوکوس کواگولاز منفی شامل استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس، استافیلوکوکوس سیوری، استافیلوکوکوس سیمولانس، استافیلوکوکوس وارنری، استافیلوکوکوس همولیتیکوس، استافیلوکوکوس کروموژنز، استافیلوکوکوس کوهنی و استافیلوکوکوس کپیتیس از نمونه‌های شیر جداسازی شدند (5). در مطالعات مختلف در سال‌های 2012، 2013 و 2017 در بلژیک، کانادا و آرژانتین گونه‌های اپیدرمیدیس، همولیتیکوس، سیوری، زایلوزوز، سیمولانس، هایکوس، وارنری و کپیتیس در نمونه‌های ورم پستان دام شناسایی شده‌اند (3، 26، 27). همچنین با استفاده از تکنیک اسپکترومتری جرمی مالدی تاف (MALDI-TOF Mass Spectrometry) نیز 19 گونه مختلف در نمونه‌‌های ورم پستان دام در سوئیس شناسایی شدند که گونه‌های زایلوزوز، کروموژنز، همولیتیکوس و سیوری غالب‌ترین گونه‌‌ها بودند (28). در مطالعه‌ای در بلژیک در سال 2017، 25 گونه مختلف استافیلوکوکوس کواگولاز منفی از نمونه‌های شیر جداسازی شدند که گونه‌‌های استافیلوکوکوس ایکوروم، استافیلوکوکوس همولیتیکوس، استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس و استافیلوکوکوس کروموژنز فراوان‌ترین گونه‌‌‌ها بودند (29). در سال 2016 در آرژانتین، گونه‌های کروموژنز، همولیتیکوس، وارنری، زایلوزوز، سیمولانس، اپیدرمیدیس و هایکوس از نمونه‌های ورم پستان دام جداسازی شدند (30). نکته حائز اهمیت در مطالعه حاضر انطباق نتایج حاصل از آزمون‌های بیوشیمیایی و مولکولی بر یکدیگر بود که مغایر با یافته‌های Bhavana و همکاران در سال 2022 (6)‌‌ می‌باشد که در آن مطالعه نتایج آزمون‌های بیوشیمیایی و توالی‌یابی 16S rDNA با یکدیگر متفاوت بودند و براین‌اساس توالی‌یابی را‌‌ به‌عنوان روش استاندارد طلایی جهت شناسایی گونه‌های استافیلوکوکوس کواگولاز منفی معرفی کردند.

به‌طور‌کلی‌‌ بر‌اساس نتایج حاصل از مطالعه حاضر‌‌ می‌توان اذعان کرد آزمون PCR با استفاده از پرایمرهای اختصاصی در مقایسه با آزمون‌های بیوشیمیایی و همچنین توالی‌یابی روشی سریع، دقیق، اختصاصی و مقرون‌به‌صرفه جهت شناسایی گونه‌های مختلف باکتریایی، از‌جمله استافیلوکوک‌های کواگولاز منفی‌‌ می‌باشد. میزان بالاتر جداسازی گونه‌های استافیلوکوکوس کواگولاز منفی از نمونه‌های شیر و ورم پستان دام‌‌ می‌تواند احتمالاً ناشی از تولید بیوفیلم توسط این سویه‌‌ها باشد که باعث ایجاد مقاومت فزاینده در باکتری‌ها در مقابل ‌‌آنتی‌بیوتیک‌ها و عوامل ضدمیکروبی و همچنین تقویت فرار از سیستم ایمنی بدن دام‌ها‌‌ می‌شود (31، 32). همچنین سویه‌های استافیلوکوکوس کواگولاز منفی عمدتاً از ورم پستان تحت بالینی جداسازی‌‌ می‌شوند که این خود باعث‌‌ می‌شود عامل ‌‌بیماری‌زا ناشناخته باقی بمانند و طبیعتاً امکان درمان آن‌ها نیز وجود نخواهد داشت (5). ازطرف‌دیگر، شیوع بالای سویه‌های استافیلوکوکوس کواگولاز منفی در مطالعه حاضر همچنین‌‌ می‌تواند ناشی از آداپته شدن و انطباق گونه‌های مختلف کواگولاز منفی با بافت پستان دام‌ها و همچنین سازگاری آن‌ها با پروتکل‌های درمانی مورد‌استفاده در دامداری‌های مورد‌بررسی باشد.

بر‌اساس نتایج حاصل از آزمون تعیین مقاومت ‌‌آنتی‌بیوتیکی مشخص شد 55 درصد سویه‌‌ها در‌مجموع نسبت به اگزاسیلین مقاوم بودند و‌‌ به‌عنوان مقاوم به‌‌ متی‌سیلین دسته‌بندی شدند و 79، 84، 71، 65، 48، 39، 77، 0، 61، 0، 43، 29 و 0 درصد نسبت به ‌‌آنتی‌بیوتیک‌های اریترومایسین، پنی‌سیلین، تتراسایکلین، تری متوپریم ـ سولفامتوکسازول، جنتامایسین، ریفامپین، سیپروفلوکساسین، کلرامفنیکل، کلیندامایسین، لینزولاید، مینوسایکلین، نیتروفورانتوئین و ونکومایسین مقاوم بودند. در مطالعه Phophi و همکاران در سال 2019 در آفریقای جنوبی، 16 درصد سویه‌‌‌های استافیلوکوکوس کواگولاز منفی مقاوم به‌‌ متی‌سیلین بودند (33). همچنین 90 درصد سویه‌‌ها حداقل نسبت به یک ‌‌آنتی‌بیوتیک مقاومت نشان دادند و بیشترین میزان مقاومت نسبت به پنی‌سیلین (88 درصد) و اریترومایسین (64 درصد) و کمترین میزان مقاومت نسبت به ونکومایسین (9 درصد) مشاهده شد. علاوه‌بر‌این 51 درصد سویه‌‌ها واجد مقاومت چندگانه بودند. در گونه کروموژنز، 63 و 54 درصد سویه‌‌ها نسبت به پنی‌سیلین و اریترومایسین مقاوم بودند و 52 درصد سویه‌‌ها مقاومت چندگانه نسبت به ‌‌آنتی‌بیوتیک‌ها داشتند. در گونه اپیدرمیدیس 65 درصد واجد مقاومت چندگانه بودند و 82، 35 و 12 درصد سویه‌‌‌‌ها نسبت به پنی‌سیلین، اگزاسیلین و ونکومایسین مقاومت نشان دادند. در گونه همولیتیکوس، 44 درصد سویه‌‌ها مقاومت چندگانه نسبت به ‌‌آنتی‌بیوتیک‌های مورد‌استفاده نشان دادند و 56 و 13 درصد مقاومت نسبت به پنی‌سیلین و اگزاسیلین در این سویه‌‌ها مشاهده شد. مقاومت ‌‌آنتی‌بیوتیکی در مطالعه حاضر بالاتر از مطالعات انجام‌گرفته در سایر کشورها، از‌جمله هندوستان، آفریقای جنوبی و سوئد بود (6، 33-35). علاوه‌بر‌این، در مطالعه‌ای در سال 2024 در اتیوپی 5/37 درصد سویه‌‌ها نسبت به اگزاسیلین مقاوم بودند و 2/54 درصد سویه‌ها نیز واجد مقاومت چندگانه بودند (5). همچنین 8/51، 7/27، 4/49، 4/43 و 8/39 درصد مقاومت نسبت به پنی‌سیلین، جنتامایسین، اریترومایسین، تری متوپریم ـ سولفامتوکسازول و تتراسایکلین در میان سویه‌‌ها مشاهده شد و 54 درصد نیز واجد مقاومت چندگانه بودند. Ebrahimi و همکاران در سال 2014 در شهرکرد نیز مقاومت بالایی را نسبت به اغلب ‌‌آنتی‌بیوتیک‌ها گزارش کردند (24). به نظر دلیل اصلی این تفاوت، ناشی از استراتژی‌های به کار گرفته‌شده جهت درمان عفونت‌های دام‌ها در کشورها و شهرهای مختلف توسط دامپزشکان و استفاده از ‌‌آنتی‌بیوتیک‌های مختلف است. همچنین در بسیاری از موارد دامداران به‌صورت خودسرانه جهت درمان عفونت‌ها اقدام‌‌ می‌کنند که این استفاده نابجا و نادرست خود از عوامل اصلی ایجاد مقاومت محسوب‌‌ می‌شود. با‌توجه‌به اینکه دامداری‌های 3 و 1 در منطقه کردان کرج و در فاصله نزدیک از یکدیگر واقع شده‌اند و دامداری شماره 2 در منطقه آسارا قرار داشت،‌‌ بر‌اساس تفاوت در فراوانی گونه‌‌ها و همچنین مقاومت ‌‌آنتی‌بیوتیکی این سویه‌‌‌ها‌‌ می‌توان نتیجه‌گیری کرد که احتمالاً این سویه‌های منتشر‌شده در دو منطقه متعلق به کلون تایپ‌های متفاوتی می‌باشند که در این مناطق و در دامداری‌ها و احتمالاً افراد مرتبط کلونیزه شده و در گردش می‌باشند که نیازمند انجام بررسی‌های دقیق‌تر با استفاده از تکنیک‌های تایپینگ جهت تعیین دقیق انتشار کلونال این سویه‌‌ها‌‌ می‌باشد.

تمام سویه‌‌های مقاوم به‌‌ متی‌سیلین در مطالعه حاضر واجد ژن mecA بودند که متفاوت و بسیار بالاتر از گزارشات سایر کشورها، از‌جمله هندوستان در سال 2024 (7/21 درصد) (5)، ترکیه در سال 2023 (25 درصد) (7)، انگلستان در سال 2015 (5/29 درصد) (36)، نپال در سال 2020 (7/70 درصد) (11)، نیجریه در سال 2017 (5/30 درصد) (37)، ایران در سال 2020 (55 درصد) (8) و فنلاند در سال 2015 (5 درصد) (38) است. این یافته کاملاً منطبق با سایر مطالعات انجام‌گرفته در کشور بر روی سویه‌‌های استافیلوکوکوس اورئوس و استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس است که تمام سویه‌‌ها از‌نظر حضور ژن mecA مثبت بودند (10، 17، 39-44) که این خود مؤید انتشار کلون تایپ‌های مشخص واجد خصوصیات مشابه در میان انسان‌ها و حیوانات در ایران است که به‌راحتی نیز در حال انتقال و انتشار در کشور می‌باشند، کما‌اینکه پیش‌تر این سویه‌های واجد ژن mecA از نمونه‌‌‌های محیطی و دامی و فراورده‌های آن‌ها نیز در ایران جداسازی شده‌اند (22، 45-49).

در مطالعه حاضر برای نخستین مرتبه طیف وسیعی از‌‌ ژن‌های مربوط به عوامل حدت در میان سویه‌های استافیلوکوکوس کواگولاز منفی مورد بررسی قرار گرفتند که مجموعه‌ای از‌‌ ژن‌های انتروتوکسینی مختلف و همولیزین‌ها همراه با ژن مربوط به لوکوسیدین پنتون ـ ولنتاین در این سویه‌‌‌ها شناسایی شدند. بر‌این‌اساس،‌‌ ژن‌های مربوط به انتروتوکسین‌های SEA (36 درصد)، SEQ (36 درصد) و SEK (34 درصد) فراوان‌ترین‌‌ ژن‌های مربوط به عوامل حدت در مطالعه حاضر بودند. در مطالعات انجام‌گرفته بر روی سویه‌های استافیلوکوکوس اورئوس جداسازی‌شده از نمونه‌های بالینی، دامی و محیطی در ایران تاکنون 100 درصد سویه‌‌ها واجد این 3 ژن بودند و سایر‌‌ ژن‌های انتروتوکسینی و عوامل حدت نیز قبلاً در میان سویه‌‌ها گزارش شده بودند (17، 22، 23، 40، 42، 44، 47، 48)، بنابراین حضور این ژن‌ها در گونه‌های کواگولاز منفی نیز مورد انتظار بود. در مطالعه‌ای در شهر همدان در سال 2020‌‌ ژن‌های sec (4/48 درصد)، seb (5/27 درصد)، see (1/12 درصد)، sem (5/5 درصد)، seh (4/4 درصد)، sed (3/3 درصد) و sea (2/2 درصد) در میان سویه‌‌های کواگولاز منفی شناسایی شدند (9) که متفاوت با مطالعه حاضر‌‌ می‌باشد. در آن مطالعه،‌‌ ژن‌های انتروتوکسینی به‌ترتیب در 46، 61، 80 درصد گونه‌های اپیدرمیدیس، همولیتیکوس و ساپروفیتیکوس حاضر بودند. در مطالعه دیگری،‌‌ ژن‌های sea و seb‌‌ به‌عنوان شایع‌ترین‌‌ ژن‌های انتروتوکسینی در میان‌‌ گونه‌های استافیلوکوکوس عامل ورم پستان گاو معرفی شدند (50). در برزیل در سال 2008‌،‌‌ ژن‌های انتروتوکسینی در 70 درصد از سویه‌های استافیلوکوکوس کواگولاز منفی عامل ایجاد مسمومیت غذایی حاضر بودند که فراوانی‌‌ ژن‌های sea و seb به‌ترتیب 38 و 29 درصد گزارش شد و‌‌ ژن‌های sec و sed نیز به‌ندرت در سویه‌‌ها یافت شدند (51). در مطالعه حاضر بر‌خلاف چند مطالعه که پیش‌تر به آن‌ها اشاره شد، هیچ‌کدام از سویه‌‌ها از‌نظر ژن seb مثبت نبودند. در‌حالی‌که Nasaj و همکاران در سال 2020 حضور هم‌زمان این دو ژن را به موقعیت کروموزومی یکسان آن‌ها نسبت داده بودند (9). به نظر‌‌ می‌رسد با‌توجه‌به ماهیت باکتریوفاژی ژن sea و ماهیت پلاسمیدی ژن seb‌‌ می‌توان عدم حضور ژن seb در میان سویه‌های مورد‌بررسی را به فقدان پلاسمیدهای مربوطه در این سویه‌‌ها نسبت داد. همچنین‌‌ ژن‌های مربوط به همولیزین‌های HLA و HLB نیز در سویه‌های کواگولاز منفی شناسایی شدند. نکته حائز اهمیت حضور 11 ژن مربوط به عوامل حدت در گونه‌های سیوری، اپیدرمیدیس و سیمولانسس در مطالعه حاضر بود که بسیار بیشتر از سایر مطالعات مشابه‌‌ می‌باشد.‌‌ به‌عنوان‌مثال، در مطالعه‌ای در شهرکرد در سال 2014 تنها دو ژن مربوط به همولیزن‌های آلفا (06/6 درصد) و دلتا (4/45 درصد) در میان سویه‌های کواگولاز منفی شناسایی گردید (24). در اتیوپی نیز فراوانی‌‌ ژن‌های hla و hlb به‌ترتیب 4/8 و 6/9 درصد گزارش گردید (5). در مطالعه Nasaj و همکاران در سال 2020، 9/87، 56 و 3/47 درصد سویه‌‌‌‌ها واجد‌‌ ژن‌های hla، hld و hlb بودند (8).‌‌ ژن‌های pvl، hlb، sec و hla به‌ترتیب در 1/22، 6/9، 6/9 و 4/8 درصد سویه‌های استافیلوکوکوس کواگولاز منفی شناسایی شدند. در مطالعه حاضر 3 درصد سویه‌‌ها حامل ژن pvl بودند که پایین‌تر از مطالعات انجام‌گرفته در اتیوپی در سال 2024 (1/22 درصد)، هند در سال 2024 (5/6 درصد) و ترکیه در سال 2023 (8/30 درصد)‌‌ می‌باشد (5، 7، 52). به‌طور‌کلی تفاوت در فراوانی‌‌ ژن‌های حدت میان گونه‌ها و سویه‌های استافیلوکوک در مطالعه حاضر نسبت به سایر مطالعات، می‌تواند تحت تأثیر تفاوت‌های جغرافیایی و ساختار ژنتیکی ایزوله‌ها باشد. بسیاری از‌‌ ژن‌های حدت در استافیلوکوک‌ها (اعم از کواگولاز مثبت و منفی) بر روی عناصر ژنتیکی متحرک (مانند پلاسمیدها یا فازهای لیزوژن) قرار دارند؛ بنابراین تفاوت در حضور یا عدم حضور این عناصر می‌تواند دلیل اصلی تفاوت میان سویه‌ها باشد. درنتیجه به‌ نظر می‌رسد در مناطق مختلف، کلون‌تایپ‌های متفاوتی در گردش می‌باشند که از‌نظر‌‌ ژن‌های حدت و ویژگی‌های ‌‌بیماری‌زایی با یکدیگر متفاوت‌اند.

نتیجه‌گیری نهایی: نتایج حاصل از  مطالعه حاضر نشان‌دهنده شیوع بالای سویه‌های استافیلوکوکوس کواگولاز منفی مقاوم و حساس به‌‌ متی‌سیلین واجد مقاومت ‌‌آنتی‌بیوتیک چندگانه و همچنین طیف وسیعی از عوامل حدت و به‌ویژه انتروتوکسین‌ها و همولیزین در میان نمونه‌‌های شیر دام‌های مبتلا به ورم پستان در دامداری‌های مورد‌نظر در کرج است. این شیرها که از‌نظر ظاهری کاملاً سالم به نظر‌‌ می‌رسند از خطر بالایی برای مصرف‌کنندگان و افراد و پرسنلی که تماس مستقیم با آن‌ها دارند برخوردار‌‌ می‌باشد. با‌توجه‌به حدت و مقاومت بالای برخی از این سویه‌ها، مطرح شدن احتمال منشأ انسانی یا بیمارستانی بودن آن‌ها نیازمند بررسی‌های تایپینگ مولکولی است. از‌آنجا‌که مطالعه حاضر محدود به سه دامداری در یک منطقه جغرافیایی خاص بود، انجام پایش‌های گسترده‌تر در سطح کشور به‌منظور تعیین الگوی مقاومت، عوامل حدت و بررسی انتشار کلونال سویه‌ها ضروری به نظر می‌رسد. با‌توجه‌به مصرف بی‌رویه و ناآگاهانه آنتی‌بیوتیک‌ها، تعیین الگوی مقاومت سویه‌ها پیش از تجویز دارو جهت کنترل مؤثر عفونت و جلوگیری از گسترش مقاومت آنتی‌بیوتیکی ضروری است. با‌این‌حال در‌مورد استافیلوکوک‌های کواگولاز منفی، باید بین سویه‌های پاتوژن و فلور طبیعی تمایز قائل شد؛ چرا‌که برخی از آن‌ها ممکن است به‌طور خودبه‌خودی در دوره خشکی بهبود یابند و حتی نقش حفاظتی در برابر پاتوژن‌های اصلی ایفا کنند.

‌‌نمونه‌گیری در مطالعه حاضر توسط یکی از کارشناسان خبره علوم دامی و پرسنل دامداری انجام گرفته است که با وجود رعایت موارد بهداشتی، احتمال آلودگی خفیف نمونه‌‌ها وجود دارد. توصیه‌‌ می‌شود در مطالعات بعدی، ‌‌نمونه‌گیری مستقیماً توسط دامپزشک انجام شود. همچنین از‌آنجایی‌که مطالعه محدود به سه دامداری در حومه کرج است، نتایج آن به کل جمعیت گاوهای شیری ایران قابل‌تعمیم نمی‌باشد؛ بنابراین انجام مطالعات آتی با ‌‌نمونه‌گیری وسیع‌تر و از مناطق مختلف توصیه‌‌ می‌شود.

ملاحظات اخلاقی

با‌توجه‌به اینکه جهت انجام مطالعه حاضر ‌‌نمونه‌گیری توسط پرسنل دامداری‌ها و با هماهنگی دامپزشکان انجام گرفته و هیچ‌گونه تماس مستقیمی با دام‌ها وجود نداشته و همچنین تمام مراحل کار نیز در آزمایشگاه پاتوبیولوژی خصوصی شخصی و بدون حمایت ارگان خاصی صورت گرفته است، هیچ‌گونه تأییدیه اخلاقی نیز برای آن اخذ نشده است؛ و تمام قوانین اخلاق در پژوهش رعایت شده است.

حامی مالی

مطالعه حاضر هیچ‌گونه کمک مالی از سازمانی‌های دولتی، خصوصی و غیرانتفاعی دریافت نکرده است.

سپاسگزاری

نویسندگان مقاله از زنده یاد، جناب آقای مهندس اسماعیل اسماعیلی راد از محققین موسسه تحقیقات علوم دامی کشور برای هماهنگی با مراکز و همکاری در‌‌ جمع‌آوری نمونه‌‌ها قدردانی و تشکر می‌نمایند.

تعارض منافع

هیچ گونه تعارض منافعی در ارتباط با این مطالعه وجود ندارد.