جداسازی اسپرم‌های منجمد حامل کروموزوم x و ‌ y گاومیش با روش شیب غلظت وارزیابی آن با روش هیبرید کردن در جا با ماده فلورسنت

نویسندگان

1 گروه علوم درمانگاهی، دانشکده دامپزشکی دانشگاه آزاد اسلامی واحد ارومیه

2 دانش آموخته‌ دانشکده دامپزشکی دانشگاه آزاد اسلامی واحد ارومیه

3 گروه‌ ‌جنین‌ ‌شناسی،‌ ‌مرکز‌ ‌تحقیقات‌ ‌پزشکی‌ ‌تولیدمثل ،‌ پژوهشکده‌ ‌رویان

چکیده

زمینه مطالعه: تعیین جنسیت اسپرم یکی از راه‌های مهم پیش انتخاب جنسی نتاج است که به همراه تلقیح مصنوعی، توانائی قابل توجهی برای بهبود رونـد اصلاح نـژاد دام‌هـا دارد. هدف‌: ‌هدف از انجام این تحقیق ارزیابی شیب غلظت ناپیوسته Allgrad درجداسازی اسپرمهای گاومیش بر اساس کروموزومهای جنسی به روش هیبرید کردن فلورسنت درجا‌ (FISH)‌ بود. روش کار: جهت جداسازی اسپرم‌های حاوی کروموزوم‌های جنسی ‌ و ‌ منی منجمد گاومیش پس از ذوب به روش شیب غلظت ستونی از غلظت نامتناوب 4 لایه‌ای از غلظت 65 تا 95 و با اختلاف 10درصد بین لایه‌های متوالی با استفاده از محیط ‌ تهیه گردید. نمونه اسپرم پس از ذوب برروی اولین لایه تیوب قرار گردید تا اسپرماتوزوئیدهای با چگالی مشابه را پس از سانتریفیوژ در یک سـطـح جمـع آوری واستخـراج نمـایـد. از روش ‌بـا پـروب رنگـی تهیـه شده گاوی برای تمایز اسپرم‌ها در محیط‌های تفکیکی استفاده گردید. شمارش اسپرماتوزوئیدها برحسب وجود سیگنال‌های رنگی قرمز و سبز که به ترتیب معرف اسپرم‌های حامل کروموزوم‌های ‌ و ‌ بود صورت گرفت. نتایج: بر اساس نتایج بدست آمده اختلاف معنی‌داری در تعداد اسپرم‌های با کروموزوم‌های‌‌X درمحیط مایع جداشده از لایه تحتانی نسب به فوقانی (3/78 در مقـابـل 7/21 درصـد)گـزارش گـردیـد(05/0 p<‌‌.) ازسـوی دیگر در تمامی نمونه‌های تحت آزمایش تعداد اسپرماتوزوئیدهای باکروموزوم‌های ‌ در مایع جداشده از لایه فوقانی (5/75 در مقابل 5/24 درصد) بیشتر بود ‌(05/0 p<‌‌.) نتیجه گیری نهایی: به طور کلی نتایج تحقیق حاضرنشان داد استفاده از ستون نامتناوب چهار لایه‌ای محیط Allgrad یک روش مطمئن برای جداسازی اسپرماتوزوئیدها منی منجمد پس از ذوب گاومیش می‌باشد. ‌ ‌

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Separation of X and Y-bearing buffalo frozen spermatozoa using gradient medium and evaluation by fluorescence in-situ hybridization

نویسندگان [English]

  • abdolreza rastegarnia 1
  • Masoud Afshani 2
  • Poopak Eftekhar Yazdi 3
چکیده [English]

BACKGROUNDS: Sperm sexing as one of the important ways for pre-selection of offspring along with artificial insemination, has the potential to considerably improve animal breeding and the efficiency of dairy and meat production. The discrepancy between X- and Y- chromosome bearing sperm is the basis of this procedure. OBJECTIVES: The aim of this study was to evaluate a discontinuous sperm isolation medium Allgrad gradient in separation of buffalo spermatozoa according to sex chromosomes by fluorescence in-situ hybridation (FISH). METHODS: A four-layer discontinuous Allgrad gradient, 65%-95% with 10% differences between each subsequent layer was prepared in gradient separation for post thaw X- and Y-bearing spermatozoa. Following centrifugation, sperm from the top and bottom fraction were aspirated and fixed on a slide. The FISH procedure was performed by using X and Y bovine specific DNA probes. At least 400 spermatozoa were scored for each sample. The proportions of X- and Y-bearing spermatozoa were determined by the presence of red or green fluorescent signals. RESULTS: There was no significant difference in the percentage of spermatozoa with the specific signals of X and Y chromosomes in the control groups. After separation, in treatment groups, the percentage of X-bearing spermatozoa in the bottom layer exceeded that of the one in the top layer (78.3 vs. 21.7) (p<0.05). Adversely, in all treatment groups the significant difference between the frequencies of Y-bearing spermatozoa in the top layers was evident (75.5vs.24.5)(p<0.05). CONCLUSIONS: This study showed that using four-step discontinuous gradient by Allgrad isolation medium was a reliable method for the separation of X- and Y-bearing frozen-thawed buffalo spermatozoa and can be more expedient for IVF in Buffalo.

کلیدواژه‌ها [English]

  • allgrad gradient
  • Buffalo
  • sex preselection
  • Sperm

فایل ها

هم رسانی

ارجاع به این مقاله

آمار