انتقال ژنEGFP به کلونی اسپرماتوگونی گوساله به روش لیپوفکسیون

نویسندگان

1 گروه علوم درمانگاهی، دانشکده دامپزشکی دانشگاه تهران، تهران- ایران

2 گروه بیوتکنولوژی، سازمان پژوهشهای علمی و صنعتی ایران، تهران- ایران

چکیده

زمینه مطالعه: در بالغین، سلول‌های بنیادی اسپرماتوگونی (SSCs) تنها سلول‌های بنیادی هستند که قادر به انتقال اطلاعات ژنتیکی به نسل بعد می‌باشند. با در نظر گرفتن این که یک SSC منفرد می‌تواند به تعداد زیادی از اسپرماتوزوآ تبدیل شود، دستکاری ژنتیکی این سلول‌ها یک تکنولوژی نوین با کاربردهای عملی در گونه‌های مختلف حیوانی را مهیا می‌سازد. هدف: در این مطالعه ارزیابی انتقال ژن (EGFP)رEnhanced Green Fluorescent Protein  به کلونی‌های اسپرماتوگونی گاوی از طریق حامل لیپوزومی و بهترین روز انکوباسیون در جذب ژن توسط کلونی‌های اسپرماتوگونی  بررسی شد. روش کار: کارایی انتقال ژن خارجی EGFP به SSCs  از طریق Lipofection در سه روز از  شروع کشت کلونی‌های اسپرماتوگونی (روز4،6 و8) توسط میکروسکوپ فلورسنت ارزیابی شد .توسط رنگ آمیزی ایمنوسیتوفلورسنت علیه مارکرهای OCT4 و Vimentin، ماهیت SSCs و سلول‌های سرتولی تأیید شد. نتایج: نتایج نشان داد که کلونی‌های ترانسفکت شده از طریق  lipofection در هر سه روز انجام ترانسفکشن در مقایسه با گروه‌های شاهد به طور معنی‌داری افزایش یافت (0.05>p). کلونی‌های ترانسفکت شده در مقایسه با گروه‌های بدون حامل ژن خارجی نیز بالاتر بود (معنی‌دار) نرخ آلوده سازی کلونی  زمانی که ترانسفکشن در روز 4 کشت  انجام شد بود بیشتر بود. نتیجهگیری نهایی: نتایج بدست آمده از این مطالعه پیشنهاد می‌کند  که لیپوفکتامین می‌تواند به منظور انتقال مستقیم DNA خارجی به کلونی اسپرماتوگونی به ویژه در روز 4 کشت به صورت ایمن به کار رود.

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Transfection of EGFP to bovine spermatogonial colony through lipofection

نویسندگان [English]

  • Zahra Fazle Elahy 1
  • parviz tajik 1
  • Khosro Hoseini Pajooh 2
  • golshid javdani shahedin 1
1 Department of Clinical Sciences, Faculty of Veterinary Medicine, University of Tehran, Tehran-Iran
2 Department of Biotechnology, Iranian Research Organization for Sciences and Technology, Tehran-Iran
چکیده [English]

 
BACKGROUND: Spermatogonial Stem Cells (SSCs) are the only stem cells in adults that can transfer genetic information to future generations. Considering that a single SSC gives rise to a vast number of spermatozoa, genetic manipulation of these cells is a potential novel technology with practical application to various animal species. OBJECTIVES: The aim of this study was to evaluate Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) gene transfection into bovine spermatogonial colonies via liposome carrier and assess the best incubation day in uptake exogenous gene by spermatogonial colonies. METHODS: Transfection efficiency EGFP gene through lipofection was determined different in three days (day 4, 6 and 8) after the beginning of the culture by fluorescent microscope. Immunofluorescent staining against OCT4 and vimentin led to the confirmation of the nature of both SSCs and sertoli cells. RESULTS: Results showed that the transfected colonies through lipofection increased significantly (p<0.05) in each three days of transfection in comparison with those of the control groups. The transfection colonies were higher (significant) in comparision with those of the free exogenous gene carrier groups. The rate of infected colonies was higher when transfection proceed day 4. CONCLUSIONS: It was concluded that lipofectamine can be used safely for direct loading of exogenous DNA to spermatogonila colony, particularly during the fourth day of culture.
 

کلیدواژه‌ها [English]

  • lipofectamine
  • spermatogonial stem cells
  • transfection
 

Anway, M.D., Folmer, J., Wright, W.W. (2003) Isolation of sertoli cells from adult rat testes: an approach to ex vivo studies of sertoli cell function. Biol Reprod. 68: 996-1002.

Bellue, A.R., Caricchia, J.C., Millette, C.F., O’Brien, D.A., Bhatnagar, Y.M., Dym, M. (1977) Spermatogonic cells of the prepubertal mouse. Isolation and characterization. J Cell Biol. 74: 1-9.

Brinster, R.L., Avarbock, M.R. (1994) Germline transmission of donor haplotype following spermatogonial transplantation. Proc Natl Acad Sci. 91: 11303-7.

Dirami, G., Ravindranath, N., Pursel, V., Dym, M. (1999) Effects of stem cell fact or and granulocyte macrophage-colony stimulationg factor on survival of porcine type A spermatogonia culture in KSOM. Biol Reprod. 61: 225-230.

Felgner, P.L., Gadek, T.R., Holm, M., Roman, R. (1987) Lipofection : a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proc Natl Sci. 84: 7413-7417.

Garrett, F.E., Goel, SH., Yasul, J., Koch, R.A. (1999) Liposome fuse with sperm cells and induce activation by delivery of impermant agents. Biochimica et Biophysica Acta. 1417: 77-88.

Horfmann, M.C. (2008) Gdnf signaling pathways whitin the mammalian spermatogonial stem cell niche. Mol Cell Endocrinol. 288: 95-103.

Hui-ming, J., Bal, L., Ren, H., MU, Y. (2011) Production of transgenic mice by type A spermatogonia-mediated gene transfer. Agricult SciChina. 10: 431-437.

Izadyar, F., Creemers, L.B., Van Dissel-Emiliani, F.M. (2000) Spermatogonial stem cell transplantation. Mol Cell Endocrinol. 169: 21-26.

Izadyar, F., Sepierenberg, G.T., Creemers, L. B., Ouden, K., Rooij, D.G. (2002) Isolation and purification of type A spermatogonia from the bovine testis. Reproduction. 124: 85-94.

Koruji, S.M., Movahedin, M., Mowia, S.J. (2007) Colony formation ability of frozen thawed spermatogonial stem cell from adult mouse. Iran J Reprod Med. 5: 109-115.

Kubota, H., Brinster, R.L. (2008) Culture of rodent spermatogonial stem cells, male germline stem cells of the postnatal animal. Methods Cell Biol. 86: 59-84.

Lai, Y., Drobinskaya, I., Chuguang, L. (2008) Genetic modification of cells fpr transplantation. Advanced Drug Delivery Reviews. 60: 146-159.

Morena, A.R., Boitani, C., Pesce, M., De felici, M., Stefanini., M. (1996) Isolation of highly purified type A spermatogonia from prepubertal rat testis. J Androl. 17: 708-717.

Nagona, M., Clayton, J., Kley, E., Mary, R. (2001) Transgenic mice produced by retroviral transduction of male germ-line stem cells. PNAS. 98: 13090-13095.

Niu, Y., Liang, SH. (2008) Progress in gene transfer by germ cells in mammals. J Genet Genomics. 35: 701-714.

Ogachi, S., Kamihira, M., You, J., Tachibana, A., Lijima, Sh. (1998) Exogene gene transfection into quail embryo using cationic lipid vesicles. J Fermentation and Bioengineering. 86: 118-120.

Qasemi-Panahi, B., Tajik, P., Movahedin, M., Moghaddam, G., Barzgar, Y., Heidari-vala, H. (2011) Differentiation of bovine spermatogonial stem cells into osteoblasts. Avicenna J Med Biotechnol. 3: 149-153.

Sciamanna, I. (2002) DNA dose and sequence dependence in sperm-mediated gene transfer. Mol Reprod Develop. 56: 301-305. 

Tajik, P., Barin, A., Movahedin, M. (2012) Nestin, a neuroectodermal stem cell marker, is expressed by bovine sertoli cells. Comp Clin Pathol. 21: 395-399.

Takehashi, M., Kanatusa-Shinohara M., Ogonuki N., Miki, H., Toyokuni, SH., Shinohara, T. (2007) Adenovirus-mediated gene delivery into mouse spermatogonial stem cells. PNAS. 104: 2596-2601.

Xiang-yang, M. (2011) Production of transgenic animals using spermatogonial stem cells. Agricult Sci China. 10: 762-768.

Younezawa, T., Furahata, Y., Hirabayashi, K., Suzuki, M., Yamanouchi, K. (2002) Protamine-Drived synthetic enhanced the efficiency of sperm-mediated gene transfer using liposome-peptid-DNA complex. J Reprod Develop. 48: 281-286.