تولید پروتئینهای نوترکیب فسفولیپاز D و پروتئین شوک حرارتی کورینه باکتریوم سودوتوبرکلوزیس

نویسندگان

گروه پاتوبیولوژی، دانشکده دامپزشکی دانشگاه شهید چمران اهواز، اهواز، ایران

چکیده

زمینه مطالعه: بیماری لنفادنیت پنیری ناشی از کورینهباکتریوم سودوتوبرکلوزیس یکی از مهم‌ترین بیماری‌های گوسفند و بز است که منجر به ضرر‌های اقتصادی دام‌پروران می‌شود. فسفولیپاز Dا(PLD) این باکتری یک اگزوتوکسین قوی است که به‌عنوان یک عامل حدت اصلی آن در نظر گرفته می‌شود و احتمالاًً در انتشار باکتری از محل عفونت به سایر قسمت‌های بدن میزبان مشارکت دارد. پروتئین‌های شوک حرارتی (HSPs) کاندیدا‌های خوبی برای تهیه واکسن‌ها هستند چون هم ایمنی هومورال و هم ایمنی سلولی را تحریک ‌می‌کنند. هدف: مطالعه حاضر باهدف تولید پروتئین‌های نوترکیب PLD و HSP60 کورینهباکتریوم سودوتوبرکلوزیس جهت فراهم شدن زمینه‌ی بررسی توان محافظت‌کنندگی و ساخت واکسن ضد این باکتری صورت گرفت. روش کار: ژن‌های PLD و HSP60، در پلاسمید pMAL-c2X کلون گردیدند و در اشرشیاکلی سویه DH5 ترانسفورمه شدند. بیان پروتئین‌ها با استفاده از روش SDS-PAGE بررسی‌شده و صحت ردیف نوکلئوتیدی محصولات کلون شده با تعیین توالی نوکلئوتیدی مورد تأیید قرار گرفتند. نتایج: نتایج نشان داد که اشرشیاکلی سویه DH5 ترانسفورمه شده به‌خوبی پروتئین‌های فوق را بیان می‌نماید. پروتئین‌های نوترکیب بیان‌شده تقریباً به‌طور کامل محلول بودند. نتیجهگیری نهایی: با توجه به امکان تولید پروتئین‌های نوترکیب فوق، در مطالعات بعدی می‌توان ایمنی‌زایی و محافظت‌کنندگی آن‌ها در برابر عفونت‌های ناشی از کورینه باکتریوم سودوتوبرکلوزیس را موردسنجش قرارداد.

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Production of the phospholipase D and heat-shock protein (HSP)-60 recombinant proteins from Corynebacterium pseudotuberculosis

نویسندگان [English]

  • Fatemeh Boroon
  • Masoud Reza Seyfi Abad Shapouri
  • masood ghorbanpoor
  • Dariush Gharibi
  • Saleh Esmaeelzadeh
Department of Pathobiology, Faculty of Veterinary Medicine, Shahid Chamran University of Ahvaz, Ahvaz, Iran
چکیده [English]

 
BACKGROUND: Caseous lymphadenitis, caused by Corynebacterium pseudotuberculosis, is one of the most important diseases of sheep and goats, causing considerable losses for herd owners. Phospholipase D (PLD) is a potent exotoxin produced by C. pseudotuberculosis and it has been considered as the major virulence factor for this bacterium, possibly contributing to the spread of the bacteria from the initial site of infection to secondary sites within the host. Heat shock proteins (HSPs) are important candidates for the development of vaccines because they are usually able to promote both humoral and cellular immune responses in mammals. OBJECTIVES: The aim of this study was the cloning and expression of the PLD and HSP60 genes of C. pseudotuberculosis, used subsequently to evaluate the protectivity of these recombinant proteins for vaccine development against this bacterium. METHODS: PLD and HSP60 genes were cloned into pMAL-c2X vector and recombinant plasmids construct was transformed to DH5 strain of E. coli. Expression of the proteins was shown by SDS-PAGE and accuracy of the cloned genes was confirmed by nucleotide sequence analysis. RESULTS: The transformed E. coli strain DH5 expressed PLD and HSP60 proteins effectively. The expressed fusion protein was found almost entirely in the soluble form. CONCLUSIONS: In the following studies the immunogenicity and protectivity of these recombinant proteins against C. pseudotuberculosis infections can be assessed.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Corynebacterium pseudotuberculosis
  • phospholipase D
  • pheat-shock protein
  • Cloning
Amann, E. (1985) Plasmid vectors for the regulated, high level expression of eukaryotic genes in Escherichia coli. Dev Biol Stand. 59: 11-22.

Ausubel, F.M., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A., Struhl, K. (1992) Short Protocols in Molecular Biology. (2nd ed.) Greene Publishing Associates and John Wiley and Sons, New York, USA.

Bastos, B.L., Dias Portela, R.W., Dorella, F.A., Ribeiro, D., Seyffert, N. (2012) Corynebacterium pseudotuberculosis: Immunological responses in animal models and zoonotic potential. J Clin Cell Immunol. S4: 005.

Braga, W.U. (2007) Protection in alpacas against Corynebacterium pseudotuberculosis using different bacterial components. Vet Microbiol. 119: 297-303.

Brown C.C., Olander, H.J., Alves, S.F. (1987) Synergistic hemolysis-inhibition titers associated with caseous lymphadenitis in a slaughterhouse survey of goats and sheep in Northeastern Brazil. Can J Vet Res. 51: 46-49.

Brown, C.C., Olander, H.J., Biberstein, E.L., Morse, S.M. (1986) Use of a toxoid vaccine to protect goats against intradermal challenge exposure to Corynebacterium pseudotuberculosis. Am J Vet Res. 47: 1116 -1119.

Chaplin, P.J., De Rose, R., Boyle, J.S., Mc Waters, P., Kelly, J. (1999) Targeting improves the efficacy of a DNA vaccine against Corynebacterium pseudotuberculosis in sheep. Infect Immun. 67: 6434-6438.

Costa, M.P., McCulloch, J.A., Almeida, S.S., Dorella, F.A., Fonseca, C.T., Oliveira, D.M., Teixeira, M.F., Laskowska, E., Lipinska, B., Meyer, R., Portela, R.W. (2011) Molecular characterization of the Corynebacterium pseudotuberculosis HSP60-HSP10 operon, and evaluation of the immune response and protective efficacy induced by HSP60 DNA vaccination in mice. BMC Research Notes: 4: 243.

Dorella, J.M.R.P.F., Fonseca, C.T., Portela, R.W., de Carvalho Azevedo, V.A. (2009) Immunization with recombinant Corynebacterium pseudotuberculosis Heat-shock protein (HSP)-60 is able to induce an immune response in mice, but fails to confer protection against infection. Open Vet Sci J. 3: 22-27.

Eggleton, D.G., Middleton, H.D., Doidge, C.V., Minty, D.W. (1991) Immunization against ovine caseous lymphadenitis: comparison of Corynebacterium pseudotuberculosis vaccines with and without bacterial cells. Aust Vet J. 68: 317-319.

Fox, J.D., Routzahn, K.M., Bucher, M.H., Waugh, D.S. (2003) Maltodextrinbinding proteins from diverse bacteria and archaea are potent solubility enhancers. FEBS Lett. 537: 53-55.

Fox, J.D., Waugh, D.S. (2003) Maltose-binding protein as a solubility enhancer. Methods Mol Biol. 205: 99-117.

Ghadrdan-Mashhadi, A., Ghorbanpoor, M., Soleimani, M. (2006) Bacteriological study of liver abscesses in sheep in Ahvaz (Iran). Pak J Biol Sci. 9: 2161-2164.

Hodgson, A.L., Bird, P., Nisbet, I.T. (1990) Cloning, nucleotide sequence, and expression in Escherichia coli of the phospholipase D gene from Corynebacterium pseudotuberculosis. J Bacteriol. 172: 1256-1261.

Markey, B.K., Leonard, F.C., Archambault, M., Cullinane, A., Maguire, D. (2013) Clinical Veterinary Microbiology. (2nd ed.) Mosby, China.

Moura-Costa, L.D., Bahia, R.C., Carminati, R., Vale, V.L.C., Paule, B.J.A., Portela, R.W., de Carvalho Azevedo, V.A. (2008) Evaluation of the humoral and cellular immune response to different antigens of Corynebacterium pseudotuberculosis in Canindé goats and their potential protection against caseous lymphadenitis. Vet immunol immunopathol. 126: 131-141.

Paton, M.W., Sutherland, S.S., Rose, I.R., Hart, R.A., Mercy, A.R. (1995) The spread of Corynebacterium pseudotuberculosis infection to unvaccinated and vaccinated sheep. Aust Vet J. 72: 266-269.

Radostits, O.M., Gay, C.C., Blood, D.C., Hinchclif, K.W., (2000) Veterinary Medicine. (9th ed.) W.B. Saunders Company, London, UK.

Songer, J.G., Libby, S.J., Iandolo, J.J., Cuevas, W.A. (1990) Cloning and expression of the phospholipase D gene from Corynebacterium pseudotuberculosis in Escherichia coli. Infect Immun. 58: 131-133.

Tehrani, A.A., Javanbakht, J., Agha Mohammad Hassan, M., Zamani, M.,  Rajabian, M.,  Akbari, H., Shafei, R. (2012) Histopathological and bacteriological study on hepatic abscesses of Herrik sheep. J Med Microb Diagn. 1: 4.

Williamson, L.H. (2001) Caseous lymphadenitis in small ruminants. Vet Clin North Am Food Anim Pract. 17: 359 -371.