تفکیک سویه های ویروس بیماری بورس عفونی جداشده از گله های طیور ایران به وسیله آنالیز منحنی ذوب با دقت بالا (High Resolution Melt)

نویسندگان

1 دانشکده دامپزشکی دانشگاه تهران

2 دانشجوی دکتری تخصصی بیماریهای طیور

3 استادیار گروه علوم درمانگاهی، دانشکده دامپزشکی دانشگاه آزاد اسلامی- واحد کرج

چکیده

زمینه مطالعه: بیماری بورس عفونی (Infectious bursal disease, IBD) بیماری با واگیری بسیار بالا در طیور جوان است. برای صنعت طیور، تمایز بین جدایه های کلاسیک حاد و فوق حاد ویروس IBD اهمیت زیادی دارد تا برنامه مناسبی برای واکسیناسیون اتخاذ شود. تست های سرولوژیک و مولکولی معمول بسیار پرزحمت، زمان بر و از نظر حساسیت متغیر می باشند. این در حالی است که منحنی ذوب با دقت بالا روشی نسبتا سریع می باشد. هدف: این مطالعه برای تعیین میزان کارآئی روش منحنی ذوب با دقت بالا برای تفریق جدایه های مختلف بر روی تعدادی از جدایه های ایرانی ویروس IBD که قبلا ماهیت آنها با استفاده از روش آنالیز RT-PCR/RFLP (با استفاده از پرایمرهای پروتئین VP2) و آنالیز سکانس برای ما مکشوف بود، طراحی شد. روش کار: در این مطالعه از جدایه های ویروس IBD برای آزمون بررسی ذوب با دقت بالا در محدوده دمایی 81 تا 92 درجه سانتی گراد پس از انجام استخراج RNA و رونوشت برداری معکوس و Real Time RT- PCR ‌استفاده شد. نتایج: با بررسی منحنی ذوب، ویروس های آزمایش شده در چهار گروه A-D دسته بندی شدند. سه سویه واکسینال D78، Gumbokal و Bursa CE در گروه A ، واکسن IBD L در گروه B ، سویه واکسینال Bursine 2 در گروه C و تمامی ویروسهای فیلد در گروه D قرار گرفتند. آنالیز نتایج منحنی ذوب با دقت بالا پس از نرمال کردن نیز نشان داد که ویروس های این مطالعه در چهار گروه ژنوتیپی HRM قرار گرفتند و سه ویروس D78، Gumbokal و Bursa CE منحنی مشابه هم و غیر قابل تفکیک از هم ایجاد کردند. اما از سایر واکسنها یا سویه های فیلد متمایز بودند. همچنین دو سویه IBD L و Bursine 2 دارای دو منحنی متفاوت و متمایز از سایر ویروس ها بودند. نتیجه گیری نهائی: از مطالعه کنونی می توان نتیجه گرفت که تکنیک بررسی منحنیreal-time RT-PCR HRM روشی مقرون به صرفه و قابل اعتماد در بین روش های مورد استفاده در حال حاضر است و به منظور شناسایی حدت جدایه های جدید ویروس بورس عفونی می تواند مورد استفاده قرار گیرد.

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Differentiation of Infectious bursal disease viruses isolated from Iranian poultry flocks using real-time RT-PCR and high resolution melt curve analysis

نویسندگان [English]

  • Seyed Mostafa Peighambari 1
  • Mehdi Cheraghchibashi 2
  • Hossein Hosseini 3
چکیده [English]

BACKGROUND: Infectious bursal disease (IBD) is a highly contagious disease of young birds. Differentiation between classical virulent and very virulent IBDV (vvIBDV) isolate is very important for the poultry industry to choose the right vaccination program. Molecular and serological tests are time consuming and have variable sensitivity. However, the melting curve analysis is relatively fast method with high precision. OBJECTIVES: This study was designed to evaluate the efficacy of the melting curve analysis for differentiation of some Iranian IBDVs which their identity had been previously determined by RT-PCR/RFLP analysis. METHODS: In this study, after RNA extraction and reverse transcription and Real Time RT- PCR of IBDVs, high melting resolution at temperatures ranging from 81 to 92°C were performed. RESULTS: The findings of this study showed that in the high resolution melting curve analysis, the viruses were classified from A to D. Three vaccine strains of D78, Gumbokal, Bursa CE; IBD L; Bursine 2; and all field viruses were placed in groups A, B, C, and D, respectively. High resolution melting curve analysis after normalization also showed all viruses of this study were placed in 4 HRM genotypic group. Three strains, D78, Gumbokal, Bursa CE, produced similar and non-differentiable curve but were different from other vaccine and field strains. Two other vaccine strains, IBD L and Bursine 2, were different from each other and other viruses. CONCLUSIONS: We concluded that the real-time RT-PCR HRM technique is cost-effective and reliable among the currently used methods and can be used for differentiation of IBDV isolates.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Infectious bursal disease
  • High resolution melt curve analysis
  • Real Time RT- PCR Poultry
  • Iran
Ashraf, S. T. (2007) Development of differential RT-PCR assays and molecular characterization of the complete VP1 gene of five strains of very virulent infectious bursal disease virus. Avian Dis. 51: 935-941.

Bahmaninejad, M.A., Hair-Bejo, M., Omar, A.R., Aini, I., Toroghi, R. (2008) Characterization of three infectious bursal disease virus isolates obtained from layer chickens in Iran. Acta Virol. 52: 167-74.

Bozorgmehri-Fard, M.H., Charkhkar. S., Hosseini, H. (2013) Detection of the Chinese Genotype of Infectious Bronchitis Virus (QX-type) in Iran. Iran J Virol. 7: 57-60.

Dibazar, S.H., Sheikhi. N., Hemmatzadeh. F., Charkhkar. S., Pourbakhsh, A. (2014) Differentiation between Vaccinal and Iranian Virulent Isolates of Newcastle Disease Virus based on F Region Genotyping by HRM Analysis. Intl J Anim Vet Adv. 6: 150-155.

Eterradossi, N., Saif, Y.M. (2008) Infectious bursal disease. In: Disease of Poultry. Saif, Y.M., Fadly, A.M., Glisson, J.R., McDougald, L.R., Nolan, L.K, and Swayne, D.E (eds.). (12th ed.) Blackwell Publishing Professionals. Ames, Iowa, USA.  p. 185-208.

Ghaniei, A., Peighambari, S.M., Razmyar, J. (2014) Sequence analysis of the vp1 gene in three very virulent Iranian infectious bursal disease virus strains. Int J Vet Res. 48: 218-222.

Ghorashi, S.A., O’Rourke, D., Ignjatovic, J., Noormohammadi, A.H. (2011) Differentiation of infectious bursal disease virus strains using real-time RT-PCR and high resolution melt curve analysis. J Virol Meth. 171: 264-271.

Ghorashi, S., Noormohammadi, A.H., Markham, P. (2010) Differentiation of Mycoplasma gallisepticum strains using PCR and high-resolution melting curve analysis. Microbiol. 156: 1019-1029.

Hewson, K., Noormohammadi, A.H., Devlin, J.M., Mardani, K., Ignjatovic, J. (2009) Rapid detection and non-subjective characterisation of infectious bronchitis virus isolates using high-resolution melt curve analysis and a mathematical model. J Arch Virol. 154: 649-660.

Hosseini, S.D., Omar, A.R., Aini, I. (2004) Molecular characterization of an infectious bursal disease virus isolate from Iran. Acta Virol. 48: 79-83.

Jackwood, D.J. (2004) Recent trends in the molecular diagnosis of infectious bursal disease viruses. Anim Health Res Rev. 5: 313-316.

Jackwood, D.J., Saif, Y.M., Hughes, J.H. (1982) Characteristics and serologic studies of two serotypes of infectious bursal disease virus in turkeys. Avian Dis. 26: 871-882.

James, P., Doherty, R., Harris, M., Bickol, N., Milner, A., Young, M. (2006) Optimal selection of individuals for BRCA mutation testing: A comparison of available methods. J Clin Onco. 24: 707-715.

Krypuy, M., Ashour, A., Etemadmoghadam, D., Hyland, S., defazio, A., Fox, S., Brenton. J., Bowtell, D., Dobrovic, A. (2007) High resolution melting for mutation scanning of TP53 exons 5-8. BMC Can. 7: 167-179.

Kusk, M., Kabell, S., Jørgensen, P., Handberg, K. (2005) Differentiation of five strains of infectious bursal disease virus: Development of a strain-specific multiplex PCR. Vet Microbiol. 109: 159-167.

Muller, H., Islam, M.R., Raue, R. (2003) Research on infectious bursal disease - the past, the present and the future. Vet Microbiol. 97: 153-165.

Razmyar, J., Peighambari, S.M. (2008) Molecular characterization of Iranian infectious bursal disease viruses. Avian Dis. 52: 665-669.

Razmyar, J., Peighambari, S.M. (2008) Rapid differentiation between very virulent and classical infectious bursal disease viruses isolated in Iran by RT-PCR/REA. Int J Vet Res. 2: 111-117.

Robertson, T., Bibby, S., O’Rourke, D., Belfiore, T., Lambie, H., Noormohammadi, A.H. (2009) Characterization of Chlamydiaceae species using PCR and high resolution melt curve analysis of the 16S rRNA gene. J Appl Microbiol. 107: 2017-2028.

Sapats, S.I., Ignjatovic, J. (2000) Antigenic and sequence heterogeneity of infectious bursal disease virus strains isolated in Australia. Arch Virol. 145: 773-785.

Shamsara, M., Ghorashi, S.A., Ahmadian, G. (2006) Cloning and nucleotide analysis of the vp2 gene of a very virulent infectious bursal disease virus isolate from Iran. Acta Virol. 50: 229-234.

Steer, P.A., O’Rourke, D., Ghorashi, S.A., Noormohammadi, A.H. (2011) Application of high-resolution melting curve analysis for typing of fowl adenoviruses in field cases of inclusion body hepatitis. Aust Vet J. 89: 184-192.

Tamiru, N.A., Silke, R. (2016) Infectious bursal disease virus in poultry: current status and future prospects. Vet Med.  7: 9-18.

Tamura, K., Stecher, G., Peterson, D., Filipski, A., Kumar, S. (2013) MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 6.0. Mol Biol Evol. 30: 2725-2729.

Tiwari, A.K., Kataria, R.S., Prasad, N., Gupta, R. (2003) Differentiation of Infectious bursal disease viruses by restriction enzyme analysis of RT-PCR amplified vp1 gene sequence. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 26: 47-53.

Van den Berg, T.P. (2000) Acute infectious bursal disease in poultry: A review. Avian Pathol. 29: 175-194.

Zierenberg, K., Raue, R., Muller, H. (2001) Rapid identification of “very virulent” strains of Infectious bursal disease virus by reverse transcription-polymerase chain reaction combined with restriction enzyme analysis. Avian Pathol. 37: 315-323.