مقایسه‌ی اثر باسیلوس‌های تجاری و بومی (Bacillus subtilis ، Bacillus licheniformis) بر برخی شاخص‌های ایمنی و آنزیم‌های سرمی بدن لارو میگوی پا سفید غربی (Litopenaeus vannamei)

نوع مقاله: بهداشت و بیماری های آبزیان

نویسندگان

1 1گروه شیلات، دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی، دانشگاه گنبد کاووس، گلستان، ایران

2 2گروه بهداشت و بیماری‎های آبزیان، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه تهران، تهران، ایران

چکیده

زمینه مطالعه: پروبیوتیک‌ها نقش مهمی در ارتقای پاسخ‌های ایمونولوژیکی میگو‌ها داشته ولی اطلاعات کمی در رابطه با تأثیر مقایسه‌ای پروبیوتیک‌های تجاری و بومی بویژه در مراحل لاروی و پست لاروی میگو وجود دارد.
هدف: این مطالعه 60 روزه با هدف تعیین تأثیر باکتری‌‎های پروبیوتیکی تجاری و بومی (Bacillus subtilis وBacillus licheniformis) بر برخی از شاخص‌های ایمنی و آنزیم‌‎های سرمی میگوی وانامی (Litopenaeus vannamei) صورت پذیرفت.
روش کار: سه جیره آزمایشی با غلظت یکسان CFU/g 106×5/1 با باکتری‎‌های تجاری و بومی مکمل سازی شدند. . شاهد (بدون مکمل سازی با پروبیوتیک)، 1D (پروبیوتیک تجاری)، 2D (پروبیوتیک تجاری+ بومی)، 3D (پروبیوتیک بومی) برای آزمایش در نظر گرفته شدند. در پایان دوره آزمایش، همولنف میگو‌ها با استفاده از سرنگ از حفره شکمی گرفته شد و جهت بررسی شاخص‌های همولنف به میکروتیوب‌‎های حاوی محلول ضد انعقاد انتقال داده شد و جهت بررسی سظح آنزیم‌های سرمی، بدن آن‌‎ها هموژن و عصاره آن مورد آنالیز بیوشیمیایی قرار گرفت.
نتایج: تعداد هموسیت کل، سلول‎‌های دانه‎دار بزرگ، سلول‎‌های نیمه دانه‎دار و هیالین در تیمارهایی که از پروبیوتیک تجاری تغذیه کردند در مقایسه با گروه شاهد افزایش یافت و اختلاف معنی‎داری بین آن‎‌ها مشاهده گردید (05/0<P). میزان آنزیم‎های آلانین آمینوترانسفراز (ALT) و آسپارتات آمینوترانسفراز (AST) بطور معنی‎داری در گروه‎های آزمایشی در مقایسه با شاهد کاهش یافت (05/0<P). با این وجود، میزان آنزیم آلکالین فسفاتاز (ALP) پست‌لاروها تحت تأثیر پروبیوتیک‎های مکمل سازی شده قرار نگرفت و معنی‎دار نبود (05/0<P).
نتیجه گیری نهایی: باسیلوس‎های پروبیوتیکی قابلیت تأثیر گذاری بالایی بر شاخص‌‎های ایمنی همولنف و کاهش میزان آنزیم‎‌های ALT و AST در پست‎لاروهای میگوی وانامی دارند و این پروبیوتیک می‎تواند مکمل مناسبی برای جیره غذایی میگوی وانامی باشد.

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Comparision of Commercial and Indigenous Bacillus (Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis) Effects on Some Immune Responses and Serum Enzymes Activity in Whiteleg Shrimp Post-Larvae (Litopenaeus vannamei)

نویسندگان [English]

  • Daruosh Abdollahi Arpanahi 1
  • Hojatallah Jafaryan 1
  • Mehdi Soltani 2
  • Mahsa Naderi Samani 2
  • Ahmad Hasanpour Fatahi 1
1 1Department of Fisheries, Faculty of Agriculture and Natural Recources, Gonbad Kavous University, Golestan, Iran
2 2Department of aquatic animal health, Faculty of Veterinary medicine, University of Tehran, Tehran, Iran
چکیده [English]

BACKGROUND: Probiotics have more functional effects on shrimp immunological                         parameters but there is less information on comparative effects of Commercial and Indigenous probiotics on post-larvae and larval stage of shrimp life.
OBJECTIVES: This 60 day study was conducted to determine the effect of probiotic bacterium commercial and allochthonous (Bacillus subtilis and Bacillus licheniformis) on some of immune parameters and serum enzymes in the whiteleg shrimp (Litopenaeus vannamei).
METHODS: Three experimental diets were supplemented with similar concentration of 1.5×106 Cfu/g by bacteria, commercial and allochthonous supplementation. Control  (without probiotic supplementation), D1 (commercial probiotic), D2 (commercial+allochthonous probiotic) and D3 (allochthonous probiotic) were used for the experiment. At the end of trial, to evaluate immune parameters, Shrimp hemolymph was collected by syringe into the ventral sinus of L. vannamei, transferred to a tube and allowed to anticoagulant. To investigate serum enzymes level, body shrimp were homogenized and extracts were analyzed biochemically.
RESULTS: Total haemocyte count (THC), large granular cells (LGC), semi granular cells (SGC) and hyaline cells (HC) treated with commercial probiotics increased in comparison with control and significant difference was observed (P<0.05). Enzyme alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST) were significantly decreased in the experimental groups compared with control (P<0.05). However, post-larvae enzyme alkaline phosphatase was not found to be significantly affected by probiotic supplementation (P>0.05).
CONCLUSIONS: The probiotic Bacillus influenced the increase of the immune parameters haemolyph and decreased serum enzymes level and it is appropriate for supplementation in the diet of whiteleg shrimp post-larvae.
 

کلیدواژه‌ها [English]

  • Probiotic
  • serum enzymes
  • immune parameters
  • Litopenaeus vannamei

میگوی پا سفید غربی (Litopenaeus vannamei) بطور گسترده در بخش‌های مختلفی از دنیا پرورش داده می‌شود. رشد سریع، بازماندگی خوب در تراکم‌های بالای پرورش و دامنه تحمل نسبت به بیماری سبب شده است تا این میگو بعنوان یک انتخاب مناسب در سیستم‌های پرورشی متراکم و نیمه متراکم در نظر گرفته شود (33،50). این گونه در حال حاضر به عنوان اولین گونه پرورشی میگو در ایران پرورش داده می‌شود. بنابراین، جیره‌های مصنوعی که بتواند احتیاجات ایمونولوژیکی و تغذیه‌ای را تأمین نماید موجب گسترش و بهبود تولید صنعتی می‌شود. به عنوان مثال باکتری باسیلوس می‌تواند آنزیم‌های خارجی زیادی را ترشح و سبب افزایش دامنه تحمل نسبت به دما و کم آبی شود، این باکتری‌ها بطور گسترده‌ای به عنوان پروبیوتیک‌های مورد قبول و شناخته شده در غذا به کار گرفته می‌شوند (27و28). مطالعات نشان می‌دهد هنگامی که این باکتری‌ها به عنوان پروبیوتیک در میگو استفاده می‌شود رشد، بازماندگی، فعالیت آنزیم‌های هضمی و قابلیت هضم ظاهری غذا بهبود یافته و موجب افزایش ایمنی می‌شوند (25،37).

سیستم ایمنی در سخت‌پوستان شامل واکنش‌های سلولی و هومورال بوده که بطور عمده‌ای وابسته به خون یا همولنف ‎آن‌ها می‌باشد. واکنش‌های سلولی شامل ذره‌خواری، تشکیل کپسول و برآمدگی کوچک از میکروارگانیزم‌ها و انگل‌ها؛ و تخریب آن‌ها به وسیله مولکول‌های میکروبیوسیدال و سیتوتوکسیک می‌باشد. از سوی دیگر، واکنش‌های هومورال شامل چندین ملکول محلول همچون لکتین‌های پلاسما، ترکیبات سیستم پروفنولکسیداز (proPO)، پپتید‌های ضد میکروبی و پروتئین‌های درگیر شده در انعقاد همولنف می‌باشد که در ترکیب با واکنش‌های سلولی؛ جانور را در برابر عوامل بیماری‎‌زا محافظت می‌نماید (32).

محققان شیلاتی برای طبقه‌بندی هموسیت‌‎ها، معیار‌های مختلفی اتخاذ کرده‌اند اما با این وجود طبقه‌بندی هموسیت‎‌های سخت‌-‎پوستان هنوز بحث برانگیز باقی مانده است. در سخت‌‎پوستان هموسیت‎‌ها‎ی سیال به طور کلی به 3 دسته شامل سلول‎‌ها‎ی دانه‎دار بزرگ (LGC)، سلول‎‌ها‎ی نیمه دانه‎دار (SGC) و هیالین (HC) طبقه‌بندی می‎شوند (15). هموسیت‎ها‎ی سیال نه فقط از طریق ذره‌خواری و کشتن عوامل عفونی بلکه با ساخت و اگزوسیتوز ترکیبات ضد میکروبی، نقش مهمی در سیستم ایمنی میگو ایفا می‎کنند (39). مطالعات صورت گرفته بر روی پارامتر‌های بیوشیمیایی سرم خون در برخی از بیماری‎‌ها‎ نشانگر بروز تغییرات معنی‎دار در برخی پارامترهای بیوشیمیایی سرم خون می‎باشد (30). پارامترهای بیوشیمیایی موجود در خون به عنوان شاخص با ارزشی برای نظارت بر سلامت و پاسخ‎ها‎ی فیزیولوژیک تغذیه می‎باشد (8). از آنجا که پارامترهای خونی شرایط نامناسب را بسیار سریع‎تر از سایر پارامترها نشان می‎دهند از آن‎ها‎ به طور وسیعی برای توصیف وضعیت سلامت جانور و ارزیابی پاسخ‎ها‎ی استرس و سازش‎ها‎ی فیزیولوژیک موجود استفاده می‎شود (4).

بیشتر تحقیقات پروبیوتیکی صورت گرفته اخیر بر روی میگوی پا سفید غربی بر روی مراحل جوانی و بلوغ متمرکز بوده است (24،49) و دانش کمی در مورد اثرات پروبیوتیک‌ها بر روی مراحل لاروی و پست لاروی وجود دارد. بنابراین، هدف از انجام این آزمایش؛ بررسی پاسخ‌های ایمونولوژیکی و سنجش آنزیمی در میگوی پا سفید غربی در نتیجه استفاده از جیره‌های حاوی پروبیوتیک‌های باسیلوسی جداسازی شده و تجاری (Bacillus subtilis; B. licheniformis) بود.

 

مواد و روش کار

سویه پروبیوتیکی و جیره: پروبیوتیک تجاری بکار رفته در این آزمایش که شامل B. licheniformis و Bacillus subtilis بود از شرکت پروتکسین آکواتک تهیه گردید. همچنین باسیلوس‌های پروبیوتیک بومی (Bacillus subtilis; B. licheniformis) مورد استفاده در این تحقیق نیز از دستگاه گوارش بچه ماهیان انگشت‎قد فیل ماهی استخراج گردید (26). در ادامه جهت آماده سازی این پروبیوتیک‌ها بر اساس دستور العمل Abdollahi Arpanahi و همکاران در 2014 عمل گردید (1). بدین صورت که اسپورهای باسیلوسی را بر روی محیط کشت تریپتیک سوی آگار (TSA) کشت داده و برای مدت 24 ساعت در دمای C° 30 انکوباسیون شدند تا پرگنه‌ها نمایان شود. سپس با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر (Biochrom, Libra S22) غلظت مورد نظر در طول موج nm 600  بر مبنای CFU/mL تعیین گردید. برای تهیه غلظت پروبیوتیک تجاری- بومی (با نسبت برابر از هر یک) نیز به همین طریق عمل گردید. در پایان غلظتCFU/g 106×5/1 را که برای هر سه تیمار آزمایشی یکسان بود از طریق اسپری نمودن به سطح غذای میگو اضافه گردید. میگوها در گروه شاهد در طول کل دوره آزمایش با جیره پایه تغذیه گردیدند. میگوها در تیمار 1D، 2D و 3D به ترتیب با جیره‌های حاوی پروبیوتیک تجاری، پروبیوتیک تجاری- بومی و پروبیوتیک بومی با غلظت بیان شده تغذیه شدند.

طرح آزمایش: میگوهای پا سفید غربی (L. vannamei) از مرکز تکثیر و پرورش آبزیان گمیشان (استان گلستان) تهیه و در همان مرکز نیز آزمایش انجام پذیرفت. میگوها در مخازن فایبرگلاس با حجم آبگیری L 50 لیتر نگه‎داری و برای یک هفته از جیره پایه با غذادهی 3 بار در روز تغذیه گردیدند. میگوهای با وزن یکسان (mg 45/6±50) بصورت تصادفی در 12 مخزن با تراکم نگه‎داری 50 قطعه در هر مخزن و 3 تکرار برای هر تیمار ذخیره سازی شدند. مخازن با آب شور دریا که از فیلترهای ریز عبور داده شده بود و با حجم تعویض آب روزانه 20 درصد، آبگیری شدند. در طول دوره پرورش درجه حرارت آب C° 32-28، شوری آب ppt 42-38، اکسیژن محلول mg/l  6 و دوره نوری 12 ساعت تاریکی و 12 ساعت روشنایی بود. میگوها روزانه 3 مرتبه با غذای تجاری شرکت هوورراش و با نرخ غذادهی روزانه 7 درصد وزن کل بدن تغذیه نمودند و بر اساس میزان غذای خورده شده واقعی میگو تنظیم گردید. روزانه باقی مانده جیره هر مخزن قبل از غذادهی بعدی از طریق سیفون کردن جمع‎آوری می‌گردید. به علاوه نرخ مرگ و میر در هر مخزن روزانه ثبت و در پایان 60 روز آزمایش، درصد بازماندگی میگوها محاسبه شد.

روشهای تحلیلی و شاخصهای ایمنی: در پایان دوره آزمایش، میگوها به مدت 24 ساعت قبل از دستکاری گرسنه مانده و تغذیه آن‌ها قطع گردید (8). نرخ افزایش رشد ویژه، ADG (بر حسب g/day) و همچنین نرخ افزایش وزن نسبی، RWG (بر حسب درصد) محاسبه گردید.

1- نرخ رشد ویژه= [لگاریتم طبیعی وزن نهایی میگو- لگاریتم طبیعی وزن اولیه میگو/ دوره پرورش×]100

2- نرخ وزن نسبی بدست آمده= [(گرم وزن نهایی میگو- گرم وزن نهایی میگو)/ گرم وزن اولیه میگو×]100

همولنفگیری: همولنف با استفاده از سرنگ استریل از حفره پریکاردیال میگو گرفته شد که برای این عمل همولنف 6 میگو را گرفته و با هم آمیخته شدند (24) و در میکروتیوب‎های کوچک که حاوی 4/0 از محلول ضد انعقاد آلزور (mmol 115 گلوکز،mmol 336 سدیم کلراید، mmol 27 سیترات سدیم و mmol 9، EDTA با pH برابر با 7) بود تزریق گردید.

شمارش هموسیتهای همولنف: از نمونه همولنف تهیه شده برای تعیین تعداد هموسیت کل (THC) و شمارش افتراقی هموسیت‎ها (DHC) استفاده شد. تعداد هموسیت کل همولنف به وسیله لام هموسیتومتر (نئوبار) و با بزرگ نمایی 40 در زیر میکروسکوپ شمارش شد. همچنین برای تعیین تابلوی هموسیتی یا شمارش افتراقی هموسیت‎ها، پس از تهیه گسترش از همولنف و خشک شدن کامل گسترش‎ها به وسیله جریان هوا، برای مدت زمان 10 دقیقه تثبیت شدند. سپس اقدام به رنگ‎آمیزی به روش می-گرانوالد-گیمسا شد و با میکروسکوپ نوری، تعداد 200 سلول هموسیت شمارش و تعداد هموسیت‎های دانه‎دار بزرگ، نیمه‎دانه‌دار و هیالین تعیین گردید (15).

میزان هموسیت کل و شمارش افتراقی هموسیت‎ها با استفاده از معادلات زیر محاسبه گردید:

تعداد هموسیت کل (THC)= سلول‌های شمارش شده×ضریب رقیق سازی×1000/ حجم اتاقک لام نئوبار  (0.1mm3)

شمارش افتراقی هموسیت‌ها (DHC)= (تعداد انواع سلول‌های هموسیتی مختلف/ هموسیت کل شمارش شده) × 100

آنزیمهایسرمی میگو: به منظور تعیین تغییرات فاکتورهای بیوشیمیایی همولنف در پست‎لاروها، به علت کوچکی اندازه آن‎ها‎ و عدم همولنف دهی به میزان کافی، از روش همگن کردن بدن آن‎ها‎ استفاده شد (34،35). نمونه‎ها‎ی هر تکرار با هم آمیخته شده (14) و در دستگاه هموژنایزر له شدند. سپس بدن له شده پست‎لاروها به لوله‎ها‎ی شیشه‎ای استریل در C° 4 انتقال داده شد و پس از آن درون دستگاه سانتریفیوژ با دور 14000 در دقیقه قرار گرفتند (34،35). در مرحله بعد مایع قسمت فوقانی لوله‎ها‎ که همان عصاره بدن می‎باشد، برای آنالیز فاکتورهای بیوشیمیایی، به آزمایشگاه منتقل گردید.

سنجش ALT و AST: آلانین آمینو ترانسفراز (ALT) که قبلاً به نام گلوتامیک پیروویک ترانس آمیناز (GPT) نامیده می‎شد، و آسپارتات آمینو ترانسفراز (AST) که قبلاً به نام گلوتامیک اگزال استیک ترانس آمیناز (GOT) نامیده می‎شد، مهم‎ترین آنزیم‎های گروه آمینو ترانسفراز‎ها یا ترانس آمیناز‎ها هستند که با انتقال واحدهای آمین، a-Keto acid را به آمینو اسیدها کاتالیز می‎کنند. برای اندازه‎گیری آنزیم‎های ALT و AST از روش IFCC و در طول موج nm 340 استفاده شد.

سنجش آلکالین فسفاتاز (ALP): آلکالین فسفاتاز آنزیم هیدرولیتیکی است که اپتیمم فعالیت آن در پی- اچ قلیایی است. برای اندازه‎گیری آن از روش DGKC (استاندارد انجمن بیوشیمی آلمان) و در طول موج nm 405 استفاده گردید .

تجزیه و تحلیل آماری: تفاوت بین میانگین‌ها برای بررسی از نظر معنی‌داری آماری با استفاده از آنالیز واریانس یک طرفه (ANOVA) تحلیل و بر اساس آزمون چند دامنه دانکن دنبال گردید. همچنین سطح معنی‌داری بکار رفته در مطالعه حاضر 05/0>P بود.

 

نتایج

در این آزمایش، تأثیر باسیلوس‎های پروبیوتیکی بر برخی پارامترهای رشد میگوی پا سفید غربی نشان داده شده است (جدول 1). نتایج آزمایش حاکی از اختلاف معنی‌داری در وزن، طول، نرخ وزن نسبی بدست آمده و نرخ رشد ویژه شدند (05/0>P). بیشترین وزن (mg 12 / 1101)، طول (mm 46/56)، نرخ رشد ویژه (78/4) و نرخ وزن نسبی (2252/8) میگوی پا سفید غربی در تیمار تغذیه شده با غذای مکمل شده با پروبیوتیک تجاری بدست آمد.

شاخصهای همولنف: اثر پروبیوتیک‌ها بر پارامترهای همولنف میگو در جدول 2 آمده است. نتایج حاصل از آنالیز داده‌ها بیانگر این بود که بکارگیری باسیلوس‌های پروبیوتیکی مورد استفاده در این آزمایش تأثیر معنی‎داری بر تعداد هموسیت کل همولنف در تیمارهای آزمایشی نسبت به گروه شاهد داشت (05/0>P). به طوری که کمترین تعداد هموسیت کل برای تیمار شاهد (106×Cell/mL 7/10) بدست آمد، در حالی که بیشترین تعداد آن در تیمار آزمایشی اول (106×Cell/mL 4/13) که پست‎لاروهای میگوی سفید غربی در آن با جیره حاوی باسیلوس‎ها‎ی پروبیوتیکی تجاری تغذیه شده بودند مشاهده گردید.

تعداد سلول‎های دانه‎دار بزرگ پست‎لاروهای میگو در تیمارهای آزمایشی نسبت به گروه شاهد اختلاف معنی‌داری را نشان دادند (05/0>P). بطوری که بیشترین تعداد از این نوع هموسیت در تیمار آزمایشی اول و معادل 106×Cell/mL 40/2 (85/17 درصد از هموسیت کل تیمار اول) بدست آمد در حالی که کمترین میزان این پارامتر در گروه شاهد و معادل 106×Cell/mL 20/1 (21/11 درصد از هموسیت کل گروه شاهد) مشاهده گردید.

تعداد سلول‎های نیمه دانه‎دار پست‎لاروها در تیمارهای آزمایشی نسبت به گروه شاهد اختلاف معنی‎داری را نشان دادند (05/0>P). به طوری که کمترین تعداد آن در گروه شاهد و معادل 9/2 (11/27 درصد از هموسیت کل گروه شاهد) و بیشترین تعداد آن در تیمار آزمایشی اول و معادل 45/3 (65/25 درصد از هموسیت کل تیمار اول) مشاهده گردید.

استفاده از باسیلوس‌های پروبیوتیکی در این مطالعه، اختلاف معنی‌داری در تعداد هیالین تیمارهای آزمایشی در مقایسه با گروه شاهد را نشان داد (05/0>P). کمترین تعداد سلول هیالین در گروه شاهد و معادل 60/6 (68/61 درصد) و بیشترین آن درتیمار آزمایشی اول 60/7 (50/56 درصد) مشاهده گردید.

آنزیمهای سرم: نتایج بدست آمده از تأثیر پروبیوتیک‌ها بر آنزیم‌های سرم بدن در جدول 3 آمده است. نتایج حاصل از آنالیز داده‌های مربوط به ALT سرم بدن پست‎لاروهای میگوی پا سفید غربی نشان داد که باسیلوس‌های پروبیوتیکی، به طور معنی‌داری میزان ALT را کاهش داده‎اند و اختلاف معنی‌داری با تیمار شاهد بدست آمد (05/0>P). کمترین میزان ALT معادلIUL-1 125 برای تیمار اول بود که در این تیمار پست‎لاروها با جیره غذایی حاوی باسیلوس‎های پروبیوتیک تجاری تغذیه شده بودند، در حالی که بیشترین میزان آن در تیمار شاهد معادل  IUL-1163 به دست آمد.

آنزیم آسپارتات آمینوترانسفراز سرم بدنی پست‎لاروهای میگو در تیمارهای آزمایشی در مقایسه با گروه شاهد اختلاف معنی‎داری را با تیمار شاهد نشان داد (05/0>P). کمترین میزان AST سرم در تیمار آزمایشی اول (IUL-11045) و بیشترین میزان آن در گروه شاهد (IUL-11560) مشاهده شد.

استفاده از باسیلوس‎های پروبیوتیکی در این مطالعه، تأثیر معنی‎داری بر ALP سرم بدن پست‎لاروهای میگو در تیمارهای مختلف نداشت (05/0<P). ولی از نظر عددی کاهش نسبی بین تیمارهای آزمایشی و گروه شاهد مشاهده شد و کمترین میزان این پارامتر در تیمار اول معادل IUL-14450 و بیشترین میزان این پارامتر در گروه شاهد و معادل  IUL-18195 بدست آمد.

 

بحث

 زندگی میگوها هم مانند سایر آبزیان ارتباط نزدیکی با میکروارگانیسم‌ها دارد، استفاده از پروبیوتیک‌ها منجر به متعادل سازی فلور میکروبی روده شده و به سبب آن عملکرد دستگاه گوارش را ارتقا می‌دهد. بدین موجب میگوهای پرورشی از عملکرد رشد بالاتری برخوردار خواهند شد (5،52،53).

در آزمایش حاضر افزایش رشد در میگوهای تغذیه شده با مکمل‌های باسیلوس‌های پروبیوتیکی در مقایسه با گروه شاهد گزارش شد. در کل پروبیوتیک‌ها با افزایش سطوح آنزیم‌های گوارشی به هضم پرروتئین‌ها، نشاسته، چربی و سلولز بهبود بخشیده و منجر به افزایش جذب مواد غذایی شده و در نهایت افزایش پارامترهای رشد را در میگو به همراه دارد (47،52)، با وجود اینکه این آنزیم‌های خارجی نسبت به آنزیم‌های مترشحه از دستگاه گوارش کمتر هستند ولی عامل محرک ترشح آنزیم‌های داخلی محسوب می‌شوند (47،53) علاوه بر این تولید مکمل‌هایی مانند بیوتین، ویتأمین B12، اسیدهای چرب، آمینو اسیدهای ضروری و بسیاری از فاکتورهای رشد ضروری توسط باسیلوس‌ها به پیشرفت و ارتقای رشد کمک می‌کند (10،45).

مکانیسم عمل پروبیوتیک‌ها در اصل به تعاملات بین گونه‌های پروبیوتیکی و فلور میکروبی میزبان یا سلول‌های ایمنی مخاط روده بستگی دارد، پارامترهای زیادی در اتصال پروبیوتیک‌ها به موکوس روده نقش دارند که از آن جمله می‌توان به شرایط محیطی و مقاومت ژنتیکی اشاره کرد (9).

Wang و همکاران در سال2012 در تحقیقی اثر باسیل‌های پروبیوتیکی را بر روی پارامترهای رشد میگوی پا سفید غربی (Litopenaeus vannamei) بررسی کردند و بیان داشتند که استفاده از این باکتری‌ها بعنوان مکمل‌های غذایی افزایش رشد و بازماندگی را در پی داشتند (48).

Ziaei-Nejad و همکاران در سال 2006 از آرتمیا فرانسیسکانای غنی سازی شده با باسیلوس‎های پروبیوتیکی تجاری به منظور رشد و بقاء در پرورش میگوی سفید هندی استفاده کردند (53). همچنین در مطالعه‎ای دیگر Rengpipat و همکاران در سال 1998 با استفاده از باسیلوس‎های پروبیوتیکی (Bacillus S11) منجر به افزایش رشد میگوی ببری سیاه (P. monodon) شدند (36).

در میگو مهم‎ترین نقش گردش هموسیت‎ها، حفاظت از جانور در برابر میکروارگانیزم‎ها‎ی مضر از طریق شرکت در بازشناسی، فعالیت ذره‌خواری و تجمع است (18،42). علی‎رغم وجود تنوع در پاسخ‎های میگو، بسیاری از آن‌ها از هموسیت‏ میگو سرچشمه می‎گیرند. هموسیت‎های میگو در مکانیسم‎ها‎ی دفاعی مانند ذره‌خواری، کپسول گذاری، تشکیل لخته و بازشناسی دخالت دارند (20). سطح هموسیت کل در پاسخ به عفونت، تغییرات محیطی و پوست اندازی در بیشتر سخت‎پوستان متفاوت است (22). هموسیت‎ها‎ی سیال نه فقط از طریق ذره‌خواری و کشتن عوامل عفونی بلکه با سنتز و اگزوسیتوز ترکیبات ضد میکروبی، نقش مهمی در سیستم ایمنی میگو ایفا می‎کنند (39).

یکی دیگر از ویژگی‌های عملکردی پروبیوتیک‌ها کمک به افزایش شرایط سلامت و کنترل زیستی بیماری‌ها از طریق بهبود فعالیت ایمنی میگواست (41). تعداد کل هموسیت‌ها بعنوان یکی از شاخص‌های سلامت میگو، جذب مواد غذایی به صورت کارآمد و بازماندگی مناسب محسوب می‌شود (31). بر اساس نتایج حاصل از این تحقیق، باسیلوس‎ها‎ی پروبیوتیکی موجب افزایش معنی‎داری در تعداد کل هموسیت‎ها‎ نسبت به گروه شاهد شدند که می‎تواند به دلیل عملکرد‎ها‎ی مختلف پروبیوتیک در بدن از جمله تأثیر مثبت بر سلول‎ها‎ی همولنف و سلامتی میگو باشد. در موافقت با نتایج این مطالعه Kongnum و Hongpattarakere در سال 2012 گزارش دادند که استفاده از پروبیوتیک لاکتوباسیلوس پلانتاروم (Lactobacillus plantarum) در جیره غذایی میگوی پا سفید غربی باعث افزایش تعداد کل هموسیت پس از رویارویی با ویبریو‌هارویی نسبت به گروه شاهد شده است (21). نتایج مشابهی نیز توسط Vieira و همکاران در سال 2007 گزاراش شده است، آن‎ها‎ بیان کردند که پروبیوتیک لاکتوباسیلوس پلانتاروم جدا سازی شده از میگوی مولد سفید غربی که به عنوان یک محرک ایمنی استفاده شده بود پس از تزریق ویبریو‌هارویی موجب افزایش تعداد کل هموسیت و همچنین افزایش باکتری اسید لاکتیک در دستگاه گوارش این میگو شد (46). افزایش در گرانولوسیت‌ها (LGC, SGC) و هیالین نتیجه فعالیت محرک ایمنی است (40) و توانایی تحریک ایمنی باسیلوس‌ها به واسطه ترکیبات اصلی دیواره سلولی آن است که منجر به افزایش ایمنی میگو می‌شود (41). همسوی با نتایج تحقیق حاضر Jussila و همکاران در سال 1997 در مطالعه‎ای تعداد هموسیت کل و تعداد هموسیت افتراقی را در لابسترهای صخره‎ای غربی (Panulirus cygnus George) تحت استرس پس از جمع آوری بررسی کردند و بیان نمودند که نسبت SGC در لابسترها افزایش نشان داده است (21). در مخالفت با این نتایج، Gullian و همکاران در سال 2004 ضمن بیان این مطلب که تغییر در تعداد افتراقی هموسیت نشان دهنده یک هشدار ایمنی است، گزارش نمودند که تحریک میگوی سفید غربی با باسیلوس و ویبریو آلجینولیتیکوس تفاوت قابل توجهی را در تعداد هموسیت کل نشان نداد اما به طور معنی‎داری باعث افزایش در جمعیت سلول‎ها‎ی هیالین شد. همچنین اگر چه هیچ گونه تفاوت معنی‎داری از لحاظ تعداد سلول‎ها‎ی دانه‎دار بزرگ و نیمه دانه‎دار مشاهد نشد و جمعیت آن‎ها‎ ثابت باقی ماند اما این سلول‎ها‎ به شدت تحریک شدند (14). کاهش در نسبت SGC می‎تواند با توجه به نوسانات HC، SGC، LGC نسبت به زمان باشد (10). نسبت LGC پایین‎تر و SGC بالاتر در لابستر صخره‎ای غربی در معرض هوا (air-exposed) کمتر از آن‎ها‎یی بود که در معرض هوا نبودند (11).

Van de Braak و همکاران در سال 2002 اشاره کردند که افزایش در هموسیت‎ها‎ی جوان و نابالغ ممکن است شاخصی از فعالیت تکثیر شدید از بافت خونساز باشد. همچنین کاهش در سلول‎ها‎ی نیمه دانه‎دار می‎تواند توسط نفوذ بالا از این نوع سلول به بافت همبند، معده و آبشش‎ها‎ در زمان عفونت‎ها‎ی باکتریایی اتفاق بیفتد (27).

کاهش معنی‌دار میزان آنزیم‌های آلانین آمینوترانسفراز (ALT) و آسپارات آمینوترانسفراز (AST) در گروه‌های آزمایشی نسبت به گروه کنترل مشاهده شد. این آنزیم‌ها شاخص‌ها سلامت هپاتوپانکراس محسوب می‌شوند و در حیواناتی که هپاتوپانکراس آن‌ها آسیب دیده است به همولنف رها می‌شوند (23).  Vargas-Alboresو همکاران در سال 2016 (44) کاهش فعالیت این دو آنزیم را در میگوی سفید Litopenaeus vannamei که از مخلوط پروبیوتیکی استفاده کرده بودند را گزارش دادند.

از جمله مکانیسم‎ها‎یی که منجر به افزایش روند رشد در میگو می‎شود، افزایش آنزیم‎ها‎ی گوارشی است. آلکالین فسفاتاز آنزیمی است که دارای انواع روده‌ای، استخوانی و کبدی است و نوع روده‌ای آن از بافت داخل روده‎ها‎ ترشح می‎گردد. میزان این آنزیم در روده بیانگر وضعیت فعالیت روده می‎باشد. مطالعات انجام شده توسط برخی محققان حاکی از این مطلب می‎باشد که میزان تغییرات سطح آلکالین فسفاتاز تحت تأثیر فاکتورهای مختلفی مانند وضعیت شیمیایی آب میزان جذب غذا، مصرف و نوع غذا، دما و سن و به علاوه ترکیبات موجود در جیره غذایی به‎ویژه، فسفر می‎باشد (39). میزان این آنزیم از لحاظ عددی در تیمار حاوی پروبیوتیک تجاری، کمتر از سایر تیمارهای آزمایشی و نیز تیمار شاهد بوده است ولی از لحاظ آماری این فاکتور معنی‎دار نشد (05/0<P).

اگر چه آلکالین فسفاتاز در بسیاری از گونه‎ها‎ی جانوری ردیابی شده است، اما اطلاعات دقیق در مورد آن در بی‎مهرگان محدود است. اخیراًً این آنزیم در سخت‎پوستانی مانند خرچنگ بهار (spring lobster)، خرچنگ منزوی (Hermit (crab، خرچنگ دراز آب شیرین (cray fish) و میگوی جاوالا (Jawala shrimp) نشان داده شده است (6).

در مجموع نتایج این مطالعه حاکی از آن است که باسیلوس‌های پروبیوتیکی منجر به ارتقای عملکرد رشد، افزایش پارامترهای همولنفی و کاهش سطح آنزیم‌های آلانین آمینوترانسفراز و اسپارات آمینوترانسفراز شده است. بنابراین پروبیوتیک‌ها مکمل‌های غذایی مناسبی در جهت بهبود شرایط پرورشی میگوی سفید غربی محسوب می‌شوند. لازم به ذکر است که در بین تیمارهای پروبیوتیکی،پروبیوتیک‌های تجاری عملکرد بهتری در مقایسه با پروبیوتیک‌های بومی از خود نشان دادند. در حالیکه Ghosh و همکاران در سال 2002 در تحقیق خود بیان داشتند که باکتری‌های جدا شده از دستگاه گوارش فیل ماهی عملکرد بهتری نسبت به نوع تجاری آن بر ماهی داشتند (13)، همچنین Jafaryan و همکاران در سال 2011 باکتری‌های زیست یار بومی را نسبت به غیر بومی کارآمدتر دانستند (19). تفاوت در عملکردهای متفاوت باکتری‌های زیست یار می‌تواند به ژنتیک، تغذیه و فاکتورهای محیطی برگردد(3). البته تفاوت در شرایط محیط گوارشی ماهی (محل جداسازی باکتری‎ها‎ی پروبیوتیک بومی) و میگو، و یا استفاده از سویه‎ها‎ی برتر در پروبیوتیک تجاری نیز می‌تواند از جمله علل تفاوت عملکرد پروبیوتیک‌ها تجاری و بومی باشد.

 

تشکر و قدردانی

بدین‎وسیله از مجموعه دانشگاه گنبد کاووس، آزمایشگاه آبزی‎پروری و همچنین مرکز تکثیر و پرورش آبزیان گمیشان به جهت فراهم آوردن تسهیلات لازم برای انجام این پروژه صمیمانه قدردانی می‎شود.

 

تعارض در منافع

بین نویسندگان  هیچ گونه تعارض در منافع  گزارش نشده است.

 

Abdollahi Arpanahi, D., Jafaryan, H., Soltani, M., GholipourKanani, H. (2014). The effect of Bacillus probiotics on the growth performance, survival rate and stress resistance of whiteleg shrimp Litopenaeus vannamei (Boone, 1931) post larvae. JFST, 3, 33-45.

Akrami, R., Ghelichi, A., Ahmadifar, E. (2011). Effect of dietary prebiotic inulin on hematological and biochemical parameters of cultured juvenile Beluga (Huso huso). J Vet Res, 2, 131-136.

Balcázar, J.L., Vendrell, D., de Blas, I., Ruiz-Zarzuela, I., Múzquiz, J.L., Girones, O. (2008). Characterization of probiotic properties of lactic acid bacteria isolated from intestinal microbiota of fish. Aquaculture, 278, 188-191. https://doi.org/10.1016/j.aquaculture.2008.03.014

Blaxhall, P. C. (1972). The hematological assessment of the health of freshwater fish. Review of selected literature. J Fish Biol, 4, 593-604. https://doi.org/10.1111/j.1095-8649.1972.tb05704

Castex, M., Lemaire, P., Wabete, N., Chim, L. (2009). Effect of dietary probiotic Pediococcus acidilactici on antioxidant defences and oxidative stress status of shrimp Litopenaeus stylirostris. Aquaculture, 294, 306-313. https://doi.org/10.1016/j.aquaculture.2009.06.016

Chander, R., Thomas, P. (2001). Alkaline phosphatase from jawala sifrimp (Acetes indicus). J Food Biochem, 25, 91-103. https://doi.org/10.1111/j.1745-4514.2001.tb00726.x

Cheng, S. Y., Chen, J. C. (2002). Joint action of elevated ambient nitrite and nitrate on hemolyph nitrogenous compounds and nitrogen excretion of tiger shrimp penaeus monodon. CBP, 131, 303-314. https://doi.org/10.1016/S1532-0456(02)00004-2

Cnaani, A., Tinman, S., Avidar, Y., Ron, M., Hulata, G. (2004). Comparative study of biochemical parameters in response to stress in Oreochomis aureus, O. mossambicus and two strains of O. niloticus. Aquac Res, 35, 1434-1440. https://doi.org/ 10.1111/j.1365-2109.2004.01167.x

De-Vrese., M, Marteau., PR.(2007). Probiotics and prebiotics: effects on diarrhea. J Nutr, 137, 803-811. https://doi.org/10.1093/jn/137.3.803S

Farzanfar A. (2006). The use of probiotics in shrimp aquaculture. FEMS Immunol Med Microbiol, 48, 149-158. https://doi.org/10.1111/j.1574-695X.2006.00116.x

Fotedar, S., Tsvetnenko, E., Evans, L. (2001). Effect of air exposure on the immune system of the rock lobster Panulirus cygnus. Mar Freshwater Res, 52, 1351-1355. https://doi.org/ 10.1071/MF01098

Fotedar, S., Evans, L., Jones, B. (2006). Effect of holding duration on the immune system of western rock lobster, Panulirus cygnus. CBP, 143, 479-487. https://doi.org/10.1016/j.cbpa.2006.01.010

Ghosh, k., Sen, S.K., Ray, A. K. (2002). Characterization of Bacillus Isolated from the gut of Rohu, Labeo rohita, fingerlings and its significance in digestion. J Appl Aquac, 12, 33-42.  https://doi.org/10.1300/J028v12n03_04

Gullian, M., Thompson, F., Rodriguez, J. (2004). Selection of probiotic bacteria and study of their immunostimulatory effect in Penaeus vannamei. Aquaculture, 233, 1–14. https://doi.org/ 10.1016/j.aquaculture.2003.09.013

Hai, N. V., Fotedar, R. (2009). Comparison of the effects of the prebiotics (Bio-Mos® and β-1,3-D-glucan) and the customised probiotics (Pseudomonas synxantha and P. aeruginosa) on the culture of juvenile western king prawns (Penaeus latisulcatus Kishinouye, 1896). Aquaculture, 289, 310-316. https://doi.org/10.1016/j.aquaculture.2009.02.001

Hose, J. E., Martin, G. G., Gerard, A. S. (1990). A decapod classification scheme integrating morphology, cytochemistry, and function. Biol Bull-US, 178, 33-45. https://doi.org/10.2307/1541535

Hosseinifar,H., Mirvaghefi, A., Majazi Amiri, B, khoshbavar Rostami, H., Darvish Bestami, K. (2011). The effect of oligoferoctos on some of hematological, serum biochemical parameters and liver enzymes of Huso huso fry (Huso huso Linnaeus, 1758). JIFRO, 20, 27-36. (in Persian). https://doi.org/10.1111/j.1365-2095.2010.00828.x

Hsieh, S. L., Ruan, Y. H., Li, Y. C., Hsieh, P. S., Hu, C. H., KUO, C. M. (2008). Immune and physiological responses in Pacific white shrimp (Penaeus vannamei) to Vibrio alginolyticus. Aquaculture, 275, 335-341. https://doi.org/10.1016/j.aquaculture.2007.12.019

Jafaryan, H., Soltani, M., Taati, M., Nazarpoor, A., Morovat, R. (2011). The comparison of pereformance of isolated sturgeon gut bacillus  (Acipenser persicus and Huso huso) with commercial microbial products on growth and survival of rainbow trout  (Oncorhynchus mykis) larvae. J Vet Res, 66, 39-46. (in Persian)

Johansson, M. W., Keyser, P., Sritunyalucksana, K., Söderhäll, K. (2000). Crustacean hemocytes and hematopoiesis. Aquaculture, 191, 45-52. https://doi.org/ 10.1016/S0044-8486(00)00418-X

Jussila, J., Jago, J., Tsvetnenko, E., Dunstan, B., Evans, L. H. (1997). Total and differential haemocyte counts in western rock lobsters (Panulirus cygnus) under postharvest stress. Mar Freshwater Res, 48, 863-867. https://doi.org/10.1071/MF97216

Kongnum, K., Hongpattarakere, T. (2012). Effect of Lactobacillus plantarum isolated from digestive tract of wild shrimp on growth and survival of white shrimp (Litopenaeus vannamei) challenged with Vibrio harveyi. Fish & Shellfish Immunol, 32, 170-177. https://doi.org/10.1016/j.fsi.2011.11.008

Kumar, V., Makkar, HPS., Becker, K. (2011). Nutritional, physiological haematological responses in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) juvenile fed detoxified jatropha curcas kernel meal. Aquac Nutr, 17, 415–467. https://doi.org/10.1111/j.1365-2095.2010.00825.x

Li, K., Zheng, T., Tian, Y., Xi, F., Yuan, J., Zhang, G., Hong, H. (2007). Beneficial effects of Bacillus licheniformis on the intestinal microflora and immunity of the white shrimp, Litopenaeus vannamei. Biotechnol Lett, 29, 525–530. https://doi.org/10.1007/s10529-006-9291-4

Lin, H.Z., Guo, Z.X., Yang, Y.Y., Zheng, W.H., Li, Z.J. (2004). Effect of dietary probiotics on apparent digestibility coefficients of nutrients of white shrimp Litopenaeus vannamei Boone. Aquac Res, 35, 1441-1447. https://doi.org/10.1111/j.1365-2109.2004.01169.x

Makridis, P., Bergh, Q., Skjermoj, J., Vadstein, O. (2001). Addition of bacteria bioencapsulated in Artemia metanauplii to a rearing system for halibut larvae. Aquac Int, 9, 225- 235. https://doi.org/10.1023/A:1016815929846

Moriarty, D.J.W. (1996). Microbial biotechnology: a key ingredient for sustainable aquaculture. Infofish Int, 4, 29–33.

Moriarty, D.J.W. (1998). Control of luminous Vibrio species in penaeid aquaculture ponds. Aquaculture, 164, 351–358. https://doi.org/ 10.1016/S0044-8486(98)00199-9

Mun˜oz, M., Vandenbulcke, F., Saulnier, D., Bache`re, E. (2002). Expression and distribution of penaeidin antimicrobial peptides are regulated by haemocyte reactions in microbial challenged shrimp. Eur J Biochem, 269, 2678- 2689. https://doi.org/10.1046/j.1432-1033.2002.02934.x

Myner, K. (1993). Changes in serum protein composition occur in Attlantic salmon, Salmo salar L. during Aeromonas salmonicida infection. J Fish Dis, 16, 601- 604. https://doi.org/10.1111/j.1365-2761.1993.tb00897.x

Olmos, J., Ochoa, L., Paniagua-Michel, J., Contreras, R. (2011). Functional feed assessment on Litopenaeus vannamei using 100% fish meal replacement by Soybean meal, high levels of complex carbohydrates and Bacillus Probiotic strains. Mar Drugs, 9, 1119-1132. https://doi.org/10.3390/md9061119

Perazzolo, L.M., Gargioni, R., Ogliari, P., Barracco, M.A.A. (2002). Evaluation of some hemato-immunological parameters in the shrimp Farfantepenaeus paulensis submitted to environmental and physiological stress. Aquaculture, 214, 19–33. https://doi.org/10.1016/S0044-8486(02)00137-0

Ponce-Palafox, J., Martine-Palacios C.A., Ross, L.G. (1997). The effects of salinity and temperature on the growth and survival rates of juvenile white shrimp, Penaeus vannamei Boone, 1931. Aquaculture, 157, 107–115. https://doi.org/ 10.1016/S0044-8486(97)00148-8

Postlethwaite, E., Mcdonald, D. (1995). Mechanisms of Na+ and C-regulation in freshwater-adapted rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) during exercise and stress. JEB, 198, 295-30. PMID: 9317841

Prodocimo, V., Galvez, F., Freire, C. A. Wood, CM. (2007). Unidirectional Na+ and Ca 2+ fluxes in two euryhaline teleost fishes, Fundulus heteroclitus and Oncorhynchus mykiss, acutely submitted to a progressive salinity increase. Comp Physiol B Biochem Syst Environ Physiol, 177, 519-28. https://doi.org/ 10.1007/s00360-007-0150

Rengpipat, S., Phianphak, W., Piyatiratitvorakul, S., Menasveta, P. (1998). Effects of probiotic bacterium on black tiger shrimp Penaeus monodon survival and growth. Aquaculture, 167, 301-313. https://doi.org/ 10.1016/S0044-8486(98)00305-6

Saeed, Z.N., Mehran, H.R., Ghobad, A.T., Donald, L.L., Ali-Reza, M., Mehdi, S. (2006). The effect of Bacillus spp. bacteria used as probiotics on digestive enzyme activity, survival and growth in the Indian white shrimp Fenneropenaeus indicus. Aquaculture, 252, 516–524. https://doi.org/10.1016/j.aquaculture.2005.07.021

Sknoberg, D. I., Yogev, L., Hardy, R.W., Dong, F. M. (1997). Metabolic response to dietary phosphorus intake in Rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Aquaculture, 157, 11-24. 10. https://doi.org/1016/S0044-8486(97)00141-5

Smith, V.J., Brown, J.H., Hauton, C. (2003). Immunostimulation in crustaceans: does it really protect against infection?. Fish Shellfish Immunol, 15, 71–90. PMID: 12833917

Sritunyalucksana, K., Gangnonngiw, W., Archakunakorn, S., Fegan, D., Flegel, TW. (2005). Bacterial clearance rate and a new differential hemocyte staining method to assess immunostimulant activity in shrimp. Dis Aquat Organ, 63, 89–94. https://doi.org/10.3354/dao063089

Tseng, DY., Ho, PL., Huang, SY., Cheng, SC., Shiu, YL., Chiu, CS., Liu, CH. (2009). Enhancement of immunity and disease resistance in the white shrimp, Litopenaeus vannamei,by the probiotic, Bacillus subtilis E20. Fish Shellfish Immunol, 26, 339-44. https://doi.org/ 10.1016/j.fsi.2008.12.003

Tzou, P., De Gregorio, E., Lemaitre, B. (2002). How Drosophila combats microbial infection: a model to study innate immunity and host-pathogen interactions. Curr Opin Microbiol, 5, 102-110. PMID: 11834378

Van de Braak, K., Botterblom, M. H. A., Liu, W., Taverne, N., Van der Knaap,W. P. W., Rombout, J. H. W. M. (2002). The role of the haematopoietic tissue in haemocyte production and maturation in the black tiger shrimp (Penaeus monodon). Fish Shellfish Immunol, 12, 253-272. https://doi.org/ 10.1006/fsim.2001.0369

Vargas-Albores, F., Martínez-Porchas, M., Arvayo, MA., Villalpando-Canchola, E., Gollas-Galván, T. (2016). Immunophysiological Response of Pacific White Shrimp Exposed to a Probiotic Mixture of Proteobacteria and Firmicutes in Farm Conditions. N Am J Aquac, 78, 193–202. https://doi.org/ 10.1080/15222055.2016.1167797

Verschuere, L., Rombaut, G., Sorgeloos, P., Verstraete, W. (2000). Probiotic bacteria as Biological Control Agents in Aquaculture. Microbiol Mol Biol Rev, 64, 655-671. PMID:11104813

Vieira, F. N., Pedrotti, F. S., Neto, C. C. B., Mouriño, J. L. P., Beltrame, E., Martins, M. L., Ramirez, C., Arana, L. A. V. (2007). Lactic-acid bacteria increase the survival of marine shrimp, Litopenaeus vannamei, after infection with Vibrio harveyi. Braz J Oceanogr, 55, 251-255. https://doi.org/10.1590/S1679-87592007000400002

Wang Y.B., Xu Z.R. (2007). Effect of probiotics for common carp (Cyprinus carpio) based on growth performance and digestive enzyme activities. Anim Feed Sci Technol, 127, 283-292. https://doi.org/10.1016/j.anifeedsci.2005.09.003

Wang, Y., Fu, L., Lin, J. (2012) Probiotic (Bacillus coagulans) cells in the diet benefit the white shrimp Litopenaeus vannamei. J Shellfish Res, 31, 855-860. https://doi.org/10.2983/035.031.0333

Wang, Y.B., Xu, Z.R., Xia, M.S. (2005). The effectiveness of commercial probiotics in northern white shrimp Penaeus vannamei ponds. Fish Sci, 71, 1036–1041. https://doi.org/ 10.1111/j.1444-2906.2005.01061.x

Williams, A.S., Davis, D.A., Arnold C.R. (1996). Density-dependent growth and survival of Penaeus setiferus and Penaeus vannamei in a semi-closed recirculating system. J World Aquacult Soc, 27, 107–112. https://doi.org/10.1111/j.1749-7345.1996.tb00600.x

Yang, S. P., Wu, Z. H., Jian, J. C., Zhang, X. Z. (2010). Effect of marine red yeast Rhodosporidium paludigenum on growth and antioxidant competence of Litopenaeus vannamei. Aquaculture, 309, 62-65. https://doi.org/10.1016/j.aquaculture.2010.09.032

Yanbo W., Zirong X. (2006). Effect of probiotics for common carp (Cyprinus carpio) based on growth performance and digestive enzyme activities. Anim Feed Sci Technol, 127, 283-292. https://doi.org/10.1016/j.anifeedsci.2005.09.003

Ziaei-Nejad, S., Rezaei, M. H., Takami, G. A., Lovett, D. L., Mirvaghefi, A. R., Shakouri, M. (2006).The effect of Bacillus spp. bacteria used as probiotics on digestive enzyme activity, survival and growth in the Indian white shrimp Fenneropenaeus indicus. Aquaculture. 252:516-524. https://doi.org/10.1016/j.aquaculture.2005.07.021