بررسی حضور و مقایسه فراوانی iss و bor، به عنوان دو ژن مؤثر در مقاومت سرمی، در اشریشیاکلی جداشده از شترمرغ های به ظاهر سالم با اشریشیاکلی جداشده از طیور مبتلا به کلی باسیلوز

نوع مقاله: میکروبشناسی و ایمنی شناسی

نویسندگان

1 دانش آموخته دکتری عمومی دامپزشکی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه زابل، زابل، سیستان و بلوچستان، ایران

2 گروه پاتوبیولوژی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه زابل، زابل، سیستان و بلوچستان، ایران

3 گروه علوم درمانگاهی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه زابل، زابل، سیستان و بلوچستان، ایران

چکیده

 
زمینه مطالعه: مکانیسم پاتوژنز و نقش فاکتورهای حدت اشریشیاکلی بیماریزای طیور هنوز مبهم است. همان‌طور که صنعت تکثیر و پرورش شتر‌مرغ رو به رشد است، ارتباط بین شترمرغ و طیور اهلی نیز احتمالاًً رو به افزایش می‌باشد. گزارشاتی وجود دارد مفید بودن مطالعه همزمان دو ژن حدت iss و bor به علت شباهت ساختمانی و عملکردی آن‌ها را در اشریشیاکلی نشان داده است.
هدف: بررسی حضور و مقایسه فراوانی دو ژن مؤثر در مقاومت سرمی در اشریشیاکلی جدا‌شده از شترمرغ‌های به‌ظاهر سالم  با اشریشیاکلی جدا‌شده از مدفوع طیور مبتلا به کلی‌باسیلوز.
روش کار: مطالعه مقطعی-توصیفی است. حضور ژن‌های iss و bor توسط PCR در اشریشیاکلی جدا شده از نمونه مدفوع شتر‌مرغ‌های به‌ظاهر سالم و مدفوع طیور مبتلا به کلی باسیلوز بررسی و مقایسه شد.
نتـایـج: فراوانی ژن iss در اشریشیاکلی جدا‌شده از مدفوع شتر‌مرغ‌های به ظاهر سالم (50درصد)، بدون تفاوت معنی‌دار، کمتر از طیور مبتلا به کلی‌باسیلوز (4/64درصد) بود (0.05>P). فراوانی ژن bor، بدون تفاوت معنی‌دار، در اشریشیاکلی جدا‌شده از مدفوع شتر‌مرغ‌های به ظاهر سالم (8/31درصد) بیشتر از طیور مبتلا به کلی‌باسیلوز (6/15درصد) مشاهده گردید (0.05>P). فراوانی جدایه‌های اشریشیاکلی حاوی هر دو ژن در مدفوع شتر‌مرغ و طیور مبتلا به کلی‌باسیلوز، بدون تفاوت معنی‌دار،  به ترتیب 2/18درصد و 1/11درصد حاصل شد (0.05>P).
نتیجـهگیـری نهایی: توزیع آماری دو ژن iss و bor در مدفوع شترمرغ‌های به‌ظاهر سالم و طیور مبتلا به کلی-باسیلوز یکسان بوده و با توجه به سالم بودن شترمرغ‌های مورد مطالعه، احتمالاًً مکانیزم‌های بیماریزایی باکتری در شترمرغ با طیور متفاوت و این جدایه‌ها، عواملی، غیر از ژن‌های مورد مطالعه در تحقیق حاضر را برای ایجاد بیماری در شترمرغ به کار می‌گیرند که این مطلب نیاز به بررسی ژن‌های حدت بیشتری در این جدایه‌ها دارد. به‌علاوه، می‌توان مدفوع شتر‌مرغ را به عنوان منبعی برای جابجایی ژن iss و bor بین طیور در نظر گرفت.
 

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Presence of Two Genes Involved in Serum Resistance of Escherichia coli Isolated From Healthy Ostriches in Comparison With Infected Poultry by Colibacillosis

نویسندگان [English]

  • Afsaneh Hosseini 1
  • Saeed Salari 2
  • Ahmad Rashki 2
  • Mohammad Jahantigh 3
1 DVM, Faculty of Veterinary Medicine, University of Zabol, Sistan and Baluchistan, Iran
2 Department of Pathobiology, Faculty of Veterinary Medicine, University of Zabol, Sistan and Baluchistan, Iran
3 Department of Clinical Sciences, Faculty of Veterinary Medicine, University of Zabol, Sistan and Baluchistan, Iran
چکیده [English]

BACKGROUND: The mechanism of pathogenesis and the role of virulence factors of avian pathogenic E. coli is still ill-defined. The ostrich industry is expanding, resulting in the interaction between poultry and ostrich. It is reported that the investigation of iss and bor virulence genes together, due to their structural and functional similarities, is valuable.
Objectives: The investigation and comparison of presence of two genes involved in serum resistance, iss and bor, in E. coli isolated from apparently healthy ostriches and poultry with colibacillosis.
Methods: As a cross-sectional study, E. coli was recovered from fecal samples of apparently healthy ostriches and poultry with colibacillosis, and iss and bor genes were screened and compared via PCR in E. coli isolates.
Results: iss frequencies, with no statistical difference, were 50% and 64.4% in E. coli isolated from apparently healthy ostriches and poultry with colibacillosis, respectively (P>0.05). 31.8% and 15.6% of E. coli isolated from apparently healthy ostriches and poultry with colibacillosis were positive for bor, respectively, with no statistical difference (P>0.05). 11.1% of isolates from colibacillosis and 18.2% of isolates from apparently healthy ostriches feces, with no statistical difference, were positive for both genes (P>0.05).
Conclusions: Equal statistical distribution of both genes, bor and iss, between apparently healthy ostriches and poultry with colibacillosis and the health level of studied ostriches indicated that E. coli isolated from ostrich, probably employs other virulence factors instead of bor and iss to establish a disease. This hypothesis needs to examine more virulence genes in ostrich-origin E. coli. In addition, the ostrich feces could be introduced as a source of iss and bor genes.

کلیدواژه‌ها [English]

  • bor
  • Colibacillosis
  • Escherichia coli
  • iss
  • Ostrich

کلی‌باسیلوز (Colibacillosis) یکی از مهم‌ترین بیماری‌های عفونی گله‌های طیور صنعتی در ایران و جهان می‌باشد (25) و در بین بیماری‌های متعدد طیور که احتمالاً قابل‌انتقال به انسان هستند یکی از نخستین نگرانی‌ها می‌باشد (28). از نتایج مهم این بیماری، واگیری و تلفات بالا و صدمات اقتصادی قابل‌توجهی است که سالیانه به صنعت طیور ایران تحمیل می‌کند (9،11،16،24،29،30،38،40).

علت اصلی کلی‌باسیلوز طیور،  اشریشیاکلی بیماریزای طیور (Avian Pathogenic Escherichia coli, APEC) است (25). در سال‌های اخیر، اطلاعات مفیدی در مورد عوامل حدت APEC و نیز مکانیسم‌های توسعه عفونت بکار‌گرفته شده توسط این باکتری و نیز ایجاد بیماری، با استفاده از روش‌های دقیق مولکولی حاصل شده‌است، اما علی‌رغم تلاش محققین، هنوز مکانیسم APEC و مکانیسم پاتوژنز و نقش فاکتور‌های حدت آن مبهم است (8،30،31،32). در‌نتیجه کنترل کلی‌باسیلوز در اثر کمبود این اطلاعات مختل شده است (32). ارزیابی دقیق خسارات اقتصادی مرتبط با اشکال مختلف عفونت‌های اشریشیاکلی مشکل است چرا که تفاوت در حدت جدایه‌های مختلف اشریشیاکلی و تعامل آن با پاتوژن‌های دیگر و عوامل استرس‌زای محیطی در این میان تأثیر‌گذار است (25).

تکثیر و پرورش شتر‌مرغ (Struthio camelus) در مصر، در اواخرقرن نهم، به دلیل شرایط آب‌و‌هوایی ایده‌آل آن گسترده شد (15). زمانی که ایران واردات شتر‌مرغ را آغاز کرد، صنعت پرورش شتر‌مرغ، به طور قابل‌ ملاحظه‌ای در ایران گسترش یافت (37). از طرفی، نگرانی‌هایی درباره وضعیت سلامت پرندگان وارداتی وجود دارد. خصوصاً در رابطه با امکان این که این پرندگان بتوانند به عنوان مخازن ویروس‌ها و باکتری‌های نوظهور نقش بازی کنند (43). همان طور که جمعیت شتر‌مرغ رو به رشد است، ارتباط بین شتر‌مرغ‌ها و طیور اهلی احتمالاًً رو به افزایش است. اثر این وضعیت روی صنعت مرغ‌داری، پنهان باقی مانده است (14،26). علی‌رغم اهمیّت اشریشیاکلی به عنوان بیماریزای طیور، مکانیسم‌های حدت پایه بکار گرفته شده توسط اشریشیاکلی برای ایجاد بیماری در پرندگان بویژه شتر‌مرغ‌ پنهان باقی مانده و ویژگی باکتریایی منحصر به فردی که به عنوان نشانی برای ایزوله‌های دارای حدت باشد، شناخته نشده ‌است (26). Tobias  و همکاران در سال 2012 بررسی‌هایی روی شتر‌مرغ انجام دادند و بیان کردند که بیماری‌هایی که بوسیله اشریشیاکلی ایجاد می‌شوند به عنوان خسارات مهمی برای انسان و حیوانات مطرح هستند (42). با توجه به گسترش مزارع پرورش شتر‌مرغ در کشور و توجّه فراوان مسئولین و نیز دامپروران با این جنبه نوین صنعت دامپروری، آگاهی از شیوه صحیح نگه‌داری این حیوان، پیش‌گیری از بیماری‌های آن و نیز در صورت امکان روش‌های مؤثر درمان این بیماری‌ها از اهمیت ویژه‌ای برخوردار است. لازم به ذکر است به علت جوان بودن این صنعت اطلاعات زیادی درخصوص نحوه نگهداری و پرورش آن نیز در دسترس نمی‌باشد در‌حالی‌که بایستی این صنعت را از جهات بسیاری مانند پرورش و تولید و جنبه‌های ژنتیکی و اصلاح نژادی، رفتار‌شناسی، تجهیزات مورد‌نیاز و موارد دیگری مورد بررسی قرار داد و کمبود‌های آن را توسط تحقیقات علمی انجام گرفته، برطرف نمود تا بدین ترتیب شاهد برطرف شدن مشکلات موجود و ارائه تکنیک‌های پرورشی کارآمد بوده تا بتوان به دنبال آن به بیش‌ترین میزان برگشت سرمایه و کم‌ترین ریسک سرمایه‌گذاری دست یافت (26،35،36،41). از آن‌جا که عوامل بیماریزای طیور صنعتی و شتر‌مرغ‌سانان با هم مشابهند، احتمالاً همان قوانین بهداشتی و کنترلی مورد‌استفاده در مزارع پرورش طیور صنعتی و بوقلمون‌ها برای این پرنده‌ها نیز می‌تواند تا حدودی صادق باشد (32،36).

مقاومت سرمی در بسیاری از انواع میکروارگانیسم‌های پاتوژن مهم است و یکی از با‌ارزش‌ترین فاکتورهای حدت باکتریایی جهت مطالعه بویژه در بیماری کلی باسیلوز طیور محسوب می‌شود (22) به علت این که شکل بروز کلی-باسیلوز طیور اکثراً سپتی‌سمی است و این فاکتور حدت، نقش مهمی در پاتوژنز این بیماری دارد (39).

ژن borا(blue open reading frame gene) با ژن افزایش‌دهنده بقای سرمی یا issا(increased serum survival gene) که در شرایط آزمایشگاهی، مقاومت باکتریایی به کمپلمان سرم را افزایش می‌دهد، شباهت زیادی دارد (4). محصولات این دو ژن حدت، دارای شباهت ساختاری و عملکردی می‌باشند. (22). ژن bor تنها ژن فاژی است که روی حساسیت سرمی میزبان لیزوژنی مؤثر است و توالی آن در تعداد زیادی از سویه‌های اشریشیاکلی یافت شود (3). فعالیت ژن bor به عنوان اولین مثالی شناخته می‌شود که عملکرد یک فاژ را به طور مستقیم در مقاومت به ایمنی به عهده دارد (27). ژن iss برای اولین بار توسط Binns و همکاران در سال 1979 توصیف گردید (6) و در پلاسمید ColV در اشریشیاکلی به صورت محافظت‌شده قرار دارد (19). به نظر میرسد مطالعه همزمان این دو ژن به علت شباهت بالای ساختمانی و عملکردی مفید باشد (39). از طرفی، کنترل بیماری‌های باکتریایی، بدون آگاهی در زمینه عوامل حدت و روش‌های بیماریزایی باکتری به سادگی قابل ‌دسترس نخواهد بود و در این تحقیق سعی شده است که با تعیین فراوانی و مقایسه فراوانی دو ژن حدت، به نزدیک شدن به این موضوع، در منطقه مورد مطالعه، کمک شود.

هدف از مطالعه حاضر بررسی حضور و مقایسه فراوانی iss و bor، به عنوان دو ژن مؤثر در مقاومت سرمی، در اشریشیاکلی جدا‌شده از شتر‌مرغ‌های به‌ظاهر سالم با اشریشیاکلی جدا‌شده از طیور مبتلا به کلی‌باسیلوز در منطقه بیرجند است.

 

مواد و روش کار

جامعه آماری و روش نمونهگیری: نمونه‌گیری به روش تصادفی ساده از مزارع مختلف شتر‌مرغ و مرغ‌داری‌های منطقه بیرجند از اردیبهشت 1394 تا شهریور 1394 انجام شد. تعداد 59 نمونه‌ی مدفوع از شتر‌مرغ‌های به ظاهر سالم و 54 نمونه‌ مدفوع از طیور تلف شده از بیماری کلی‌باسیلوز از منطقه بیرجند به روش نمونه برداری مستقیم از رکتوم جمع‌آوری شد و سپس در کمترین زمان در کنار یخ به آزمایشگاه میکروبیولوژی دانشکده دامپزشکی دانشگاه زابل انتقال و در فریزر ° 80- تا شروع کار آزمایشگاهی ذخیره شد.

جداسازی اشریشیاکلی از مدفوع: پس از کد‌گذاری، نمونه‌ها در دمای اتاق یخ‌زدایی شدند و سپس هر نمونه با سوآب هموژنیزه و به صورت خطی در محیط مک کانکی کشت داده شد. سپس پرگنه‌های قرمز رنگ به محیط ائوزین متیلین بلو آگار منتقل شدند و جهت تکثیر به مدت 24-48 ساعت در دمای C° 37 گرمخانه‌گذاری گردید (45).

تایید هویت باکتری براساس آزمونهای بیوشیمیایی: جهت تفریق باکتری اشرشیاکلی از سایر باکتری‌هایی که در محیط ائوزین متیلن بلو و مک کانکی آگار رشد کرده بودند، پرگنه‌های تک این دو محیط مورد آزمون‌های بیوشیمیایی قرار گرفتند. به این ترتیب که در محیط آگار سه قندی آهن‌دار، محیط آگار سیترات، محیط اوره براث کشت داده شدند و آزمون‌های حرکت، ایندول و متیل رد و وگس پروسکائر انجام شد. برای بدست آمدن پرگنه خالص، یک پرگنه دوباره بر روی محیط ائوزین متیلین بلو آگار کشت داده شد (45).

بررسی حضور ژن iss و bor توسط واکنش زنجیرهای پلیمراز در اشریشیاکلی جداشده از مدفوع شتر مرغهای به ظاهر سالم و طیور مبتلا به کلیباسیلوز (مواد واکنش زنجیرهای پلیمراز برای ژن iss و bor): مشخصات آغازگر‌های مورد استفاده در این تحقیق در جدول 1 به تفسیر ذکر شده است. استخراج DNA به روش جوشاندن انجام شد (12). مخلوط واکنش زنجیره‌ای پلیمراز به میزان µl 25، شامل µl 5/12 مخلوط مادر(شرکت پیشگام، ایران)، µl 1 از هر کدام از آغازگرهای iss Forward و iss Reverse (شرکت سینا‌کلون، ایران)، µl 5/7 آب مقطر دیونیزه و µl 3 از DNA استخراج شده، برای جستجوی ژن iss تهیه شد. به منظور ردیابی حضور ژن bor در جدایه‌ها، از آغازگرهای bor Forward و bor Reverse (شرکت سینا‌کلون، ایران) استفاده شد. در ابتدا مخلوط واکنش زنجیره‌ای پلیمراز برای ژن bor به میزان µl 25 تهیه شد که شامل µl 5/12 از مخلوط مادر (شرکت پیشگام، ایران)، µl 1 از آغازگر bor Forward و µl 1 از آغازگر bor Reverse، اµl 5/8 آب مقطر دیونیزه و µl 2 از DNA استخراج شده بود.

برنامه مورد استفاده در دستگاه ترموسایکلر برای واکنش زنجیرهای پلیمراز برای ژن iss و bor: از دستگاه ترموسایکلر اپندروف (Programmable gradient Eppendorf’s Master cycler® pro, Eppendorf, Hamburg, Germany) برای افزوده سازی DNA استفاده شد. مراحل برنامه مورد استفاده برای ژن iss عبارت بود ‌از سه مرحله: مرحله اول شامل چهار دقیقه واسرشتگی اولیه در C° 94، مرحله دوم شامل 35 چرخه و هر چرخه شامل سه گام: گام اول، دناتوراسیون 45 ثانیه در C° 94، گام دوم شامل اتصال آغازگر‌ها به مدت 30 ثانیه در C° 54، گام سوم شامل طویل‌شدن قطعات سه دقیقه در C° 68 و مرحله سوم بسط و گسترش نهایی که به مدت 10 دقیقه در C° 72 انجام شد.

برای ژن bor، سه مرحله برنامه شامل واسرشتگی اولیه به مدت 3 دقیقه در C° 95، مرحله دوم شامل 30 چرخه و هر چرخه شامل دناتوراسیون 45 ثانیه در C° 95، اتصال آغازگر‌ها به مدت 30 ثانیه در C° 2/62 و طویل‌شدن قطعات 45 ثانیه در C° 72، و مرحله سوم بسط و گسترش نهایی که به مدت هفت دقیقه در C° 73 انجام شد.

الکتروفورز محصول واکنش زنجیرهای پلیمراز ژنهای iss و bor: ژل آگارز یک درصد در بافر TBE 0.5x تحت 80 ولت به مدت یک ساعت و 30 دقیقه برای تعیین کمیت و کیفیت تکثیر ژن‌های مورد مطالعه استفاده و پس از رنگ آمیزی با اتیدیوم‌ بروماید در دستگاه عکس برداری از ژل (Gel Documentation System, New Delhi, India) مشاهده گردید.

روش تجزیه و تحلیل آماری: داده‌ها با نرم افزار SPSS و آزمون مربع کای، تجزیه و تحلیل شد. مقدار معنی‌داری کمتر از0.05 در نظر گرفته شد.

 

نتایج

نتایج جداسازی فنوتیپی اشریشیاکلی: در این تحقیق تعداد 113 نمونه شامل 59 نمونه مدفوع از شتر‌مرغ‌های به ظاهر سالم و 54 نمونه مدفوع از طیور مبتلا به کلی‌باسیلوز جمع‌آوری گردید. از 59 نمونه مدفوع طیور مبتلا به کلی‌باسیلوز، تعداد 45 جدایه (3/83 درصد) و از 59 نمونه مدفوع از شتر‌مرغ‌های به ظاهر سالم، 44 جدایه (6/74 درصد) دارای اشریشیاکلی بودند. این نمونه‌ها از نظر حضور ژن‌های iss و bor از طریق PCR مورد مطالعه قرار گرفتند (تصاویر 1،2).

فراوانی ژنهای iss و bor در اشریشیاکلی جداشده از شترمرغهای به ظاهر سالم: طبق جدول 2، 50 درصد از اشریشیاکلی جدا‌شده از شتر‌مرغ‌های به ظاهر سالم دارای ژن iss بودند. فراوانی ژن bor نیز در اشریشیاکلی جدا‌شده از شتر‌مرغ‌های به ظاهر سالم 8/31 درصد بود. 2/18 درصد این نمونه‌ها حاوی هر دو ژن بودند. آنالیز آماری تفاوت معنی‌داری بین فراوانی دو ژن حدت در جدایه‌های شترمرغ‌های به ظاهر سالم نشان نداد (0.05<P).

فراوانی ژنهای iss و bor در اشریشیاکلی جداشده از طیور مبتلا به کلیباسیلوز: فراوانی ژن iss در اشریشیاکلی جدا‌شده از طیور مبتلا به کلی‌باسیلوز 4/64 درصد بدست آمد (جدول 2). فراوانی ژن bor در اشریشیاکلی جدا‌شده از طیور مبتلا به کلی‌باسیلوز 6/15 درصد بود. در این بررسی 1/11 درصد نمونه‌های اشریشیاکلی جدا‌شده از طیور مبتلا به کلی‌باسیلوز حاوی هر دو ژن بودند. آنالیز آماری نشان‌دهنده وجود تفاوت معنی‌دار بین فراوانی دو ژن حدت در جدایه‌های طیور کلی‌باسیلوزی بود (0.05>P).

مقایسه فراوانی ژنهای iss و bor در اشریشیاکلی جداشده از شترمرغهای به ظاهر سالم با اشریشیاکلی جداشده از طیور مبتلا به کلیباسیلوز: با توجه به جدول 2، فراوانی ژن iss در جدایه‌های شتر‌مرغ‌های به ظاهر سالم کم‌تر از جدایه‌های طیور مبتلا به کلی باسیلوز می‌باشد که این تفاوت از نظر آماری معنی‌دار نمی‌باشد (0.05<P). از طرفی فراوانی ژن bor در جدایه‌های شتر‌مرغ‌های به ظاهر سالم بیش‌تر از جدایه‌های طیور کلی‌باسیلوزی است. اگر چه باز هم آنالیز آماری تفاوت معنی‌داری را نشان نداد (0.05<P).

نتایج نشان داد که فراوانی حضور هم‌زمان هر دو ژن مؤثر در حدت در جدایه‌های شتر‌مرغ‌های به ظاهر سالم به طور میانگین به میزان 2/18 درصد و در جدایه‌های طیور مبتلا به کلی‌باسیلوز برابر با 1/11درصد می‌باشد که با انجام آزمون آماری مشاهده شد که جدایه‌های شتر‌مرغ‌های به ظاهر سالم بیشتر از جدایه‌های طیور مبتلا به کلی‌باسیلوز حامل هر دو ژن می‌باشند. اگر چه نتایج نشان دهنده بیشتر بودن فراوانی هم‌زمان دو ژن در جدایه‌های شتر‌مرغ‌های به ظاهر سالم از موارد کلی‌باسیلوزی می‌باشد، اما بین این دو تفاوت معنی‌داری مشاهده نشد (جدول 2).

 

بحث

در تحقیق حاضر حضور دو ژن حدت مقاومت به کمپلمان، ژن‌های iss و bor، در منطقه بیرجند در اشریشیاکلی جدا‌شده از شتر‌مرغ‌های به ظاهر سالم و اشریشیاکلی جدا‌شده از طیور مبتلا به کلی‌باسیلوز مورد بررسی و فراوانی این دو ژن در نمونه‌های شتر‌مرغ‌های به ظاهر سالم و طیور کلی‌باسیلوزی مورد مقایسه قرار گرفت.

کنترل کلی‌باسیلوز در ابتدا نیازمند آگاهی کامل از چگونگی تهاجم باکتری و شناسایی ژن‌های حدت می‌باشد (21) که این موضوع در مطالعه حاضر مورد توجه قرار گرفته تا با شناسایی و تعیین فراوانی دو ژن حدت که در مقاومت سرمی عامل کلی‌باسیلوز نقش دارند، علاوه بر افزایش دانسته‌ها در مورد  اشریشیاکلی جدا شده از شتر‌مرغ، گامی در زمینه کمک به کنترل کلی‌باسیلوز طیور در منطقه مورد مطالعه برداشته شود.

مقاومت به سرم یکی از مهم‌ترین عوامل دخیل در حدت APEC است (34). ژن افزایش‌دهنده بقای سرمی که در مقاومت سرمی اشریشیاکلی دخالت دارد (6) به میزان معنی‌داری در اشریشیاکلیبیماریزای طیور بیش‌تر از اشریشیاکلی جدا ‌شده از طیور سالم وجود دارد (38).

نتایج مطالعه حاضر نشان داد که فراوانی ژن iss در شتر‌مرغ‌های به ظاهر سالم و طیور کلی‌باسیلوزی در منطقه بیرجند، به ترتیب، 50 و 4/64 درصد می‌باشد که تفاوت آماری معنی‌داری مشاهده نشد. نتیجه تحقیق حاضر، به عنوان اولین گزارش فراوانی ژن‌های حدت دخیل در مقاومت سرمی در جدایه‌های اشریشیاکلی شترمرغ‌های بالغ قابل احتساب است. در اولین گزارش از فراوانی ژن iss در ایران، فراوانی این ژن در طیور به ظاهر سالم 17 درصد و در طیور بیمار 87 درصدگزارش شد (9) که دارای اختلاف معنی‌داری بود. در تحقیق Delicato و همکاران در سال 2002 گزارش کردند که ژن حدت iss، بیش‌تر در نمونه‌های کلی‌باسیلوزی نسبت به ایزوله‌های مدفوعی از پرندگان سالم وجود دارد (7)، در حالی که در تحقیق حاضر تفاوت معنی‌داری بین نمونه‌های شترمرغ‌های به ظاهر سالم و طیور کلی‌باسیلوزی مشاهده نشد. موارد فوق تایید‌کننده این موضوع می‌باشد که عوامل بیماریزا تأثیر کم‌تری روی شتر‌مرغ دارد یا این که عوامل حدت دیگری در  بیماریزایی باکتری نقش دارند و یا احتمالاً فراوانی ژن iss در گونه‌های مختلف پرندگان متفاوت است. هرچند که گزارش بیماری‌ها در شتر‌مرغ رو به افزایش است، با این حال مقاومت شتر‌مرغ به بیماری بیش‌تر از سایرین می‌باشد. با گسترش صنعت شتر‌مرغ، اهمیت کنترل بیماری‌ها در این صنعت افزایش می‌یابد و احتمالاًً عوامل بیماریزا درگیری‌های بیش‌تری در این صنعت ایجاد کنند. میزان بیماریزایی باکتری در شتر‌مرغ بسته به شرایط محیطی آن است. از طرفی در یک شتر‌مرغ سالم که تحت استرس نباشد، لنفوسیت‌ها و سایرگلبول‌های سفیدمانع از انتقال باکتری‌های موجود در روده از طریق جریان لنف به سیستم عمومی گردش خون بدن می‌شوند. در نتیجه احتمالاً درحضور درصد قابل توجهی از ژن iss، بیماری تظاهرات بالینی نشان نمی‌دهد، درحالی که همین درصد، در طیور، باعث بروز بالینی بیماری کلی‌باسیلوز شده است که این فرضیه نیازمند تحقیق بیشتری در شترمرغ‌های بیمار و مبتلا به کلی باسیلوز می‌باشد. تأثیر شتر‌مرغ روی صنعت طیور تاکنون پنهان باقی مانده است ولی این نکته باید مدنظر باشد که با توجه به نتایج مطالعه حاضر انتقال آلودگی از شترمرغ به طیور می‌تواند تلفات سنگینی را ایجاد کند (5).

ژن iss یکی از ژن‌های حدتی است که به طور مشخص در پاتوژنز بیماری حاصل از اشرشیاکلی دارای نقش است (46). Abd El Tawab و همکاران در سال 2014 تحقیقی در مورد ویژگی‌های مولکولی و فنوتیپی تعداد 153 اشریشیاکلی بیماریزای طیور، 30 اشریشیاکلی مدفوعی طیور و 36 اشریشیاکلی محیطی انجام دادند و به این نتیجه رسیدند که 90 درصد همه اشریشیاکلی‌های بیماریزای طیور، ژن iss را به عنوان یکی از ژن‌های حدت داشتند (1).

ژن iss در سروتیپ‌هایی از نواحی جغرافیایی مختلف یافت شده است (9). در اکثر مطالعات انجام شده در نقاط مختلف دنیا فراوانی iss در طیور کلی‌باسیلوزی در حدود 82-72 درصد در موارد APEC گزارش شده است (44) که با نتایج مطالعه حاضر همخوانی دارد. در بررسیKafshdouzan  و همکاران در سال 2012 بر روی اشریشیاکلی جدا شده از کلی‌باسیلوز طیور، فراوانی ژن iss، 2/68 درصد بدست آمد (24). Wen-jie و همکاران در سال 2008 در بررسی 216 جدایه اشریشیاکلی بیماریزای طیور در طیور مبتلا به کلی‌باسیلوز را در نقاط مختلف چین فراوانی ژن iss را 8/58 درصد بدست آوردند (44). در بررسی Jeong و همکاران در سال 2011 روی ژن‌های حدت 101 سویه اشریشیاکلی بیماریزای طیور جدا‌شده از طیور عفونی، فراوانی ژن iss 2/78 درصد بود (17).

با توجه به فراوانی نسبتاًً بالای ژن iss در طیور کلی‌باسیلوزی، می‌توان این ژن را به عنوان عاملی جهت شناسایی بیماری کلی‌باسیلوز در منطقه مورد مطالعه در تحقیق حاضر در نظر گرفت (33). با توجه به مطالعات مختلف در نقاط مختلف دنیا، فراوانی iss دارای حداقل میزان 5/41 در سال 2009 و حداکثر میزان 4/96 در سال 2013 می‌باشد (2).

ژنbor اولین بار توسط Barondess و Beckwith در سال 1990 کشف شد که مشخصاً بقای سلول میزبان اشریشیاکلی در سرم حیوان را افزایش می‌دهد (3،4). این ویژگی به خوبی به عنوان مشخصه بیماریزایی باکتری شناخته شده است (3،4،23). تاکنون هیچ مطالعه‌ای در ارتباط با بررسی حضور و فراوانی ژن‌های bor و iss در شتر‌مرغ و مقایسه آن با  اشریشیاکلی جدا‌شده از طیور مبتلا به کلی‌باسیلوز در ایران صورت نگرفته است. لذا براساس بررسی منابع موجود، این تحقیق به عنوان اولین گزارش ژن bor در شتر‌مرغ بالغ در ایران محسوب می‌شود. نتایج تحقیق حاضر، فراوانی نسبتاًً بالایی از ژن bor در شتر‌مرغ‌های به ظاهر سالم و طیور کلی‌باسیلوزی را نشان داد. تحقیقات نشان داده‌اند که ژن افزایش‌دهنده بقای سرمی یا iss (6) نقش مهم‌تری در ایجاد مقاومت به کمپلمان نسبت به ژن bor دارد (46).

در مطالعه حاضر، میزان فراوانی ژنbor در اشریشیاکلی جدا‌شده از شتر‌مرغ‌های به ظاهر سالم 8/31 درصد و در اشریشیاکلی جدا‌شده از طیور مبتلا به کلی‌باسیلوز 6/15 درصد بود. با توجه به فراوانی آماری یکسان ژن bor در شترمرغ و اشریشیاکلی جدا‌شده از طیور مبتلا به کلی‌باسیلوز به نظر می‌رسد می‌توان شترمرغ را به عنوان منبعی برای جابجایی این ژن بین طیور در نظر گرفت. به نظر می‌رسد برای تشخیص بیماری کلی‌باسیلوز در شتر‌مرغ نسبت به طیور کلی‌باسیلوزی، ژن bor در کنار ژن iss کارایی زیادی در منطقه مورد مطالعه نخواهد داشت، زیرا بین طیور بیمار و شترمرغ سالم تفاوت معنی‌داری از نظر فراوانی دو ژن مشاهده نگردید. با تشخیص سریع‌تر بیماری در طیور و به خصوص در شتر‌مرغ، هزینه‌های درمان کاهش یافته، از طرفی بیماری به سرعت تحت کنترل قرار می‌گیرد. در نتیجه تولید افزایش می‌یابد و ضرر‌های اقتصادی بیماری حاصل از اشریشیاکلی وارد سیر نزولی خواهد شد. باتوجه به تأثیر روی سلامت عمومی و به دلیل احتمال انتقال ژن‌های حدت از شترمرغ به طیور اهمیت بررسی فاکتور‌های حدت در شترمرغ دوچندان می‌شود (13،14).

فراوانی ژن‌های حدت در اشریشیا کلی بیماریزای طیور براساس مکان جغرافیایی و میزبان متفاوت است (10). همچنین، مطالعات بسیاری پیشنهاد کرده‌اند که تعیین و تخمین توزیع پاتوتیپ انواع باکتری‌های بیماریزا در مناطق جغرافیایی و میزبان‌های مختلف، از جمله اشریشیا کلی بیماریزای طیور در سطح مولکولی می‌تواند به عنوان رهیافتی برای کنترل کلی باسیلوز در نظر گرفته شود. این هدف با تعیین فراوانی همزمان ژن‌های حدت قابل انجام است (20، 18). به علت شباهت ساختمانی و عملکردی دو ژن حدت bor و iss و این نکته که هر دو حفاظت شده‌اند، مطالعه همزمان این دو در مطالعه APEC و کنترل کلی‌باسیلوز طیور بسیار حائز اهمیت است (31). نتایج تحقیق حاضر نشان داد که فراوانی حضور هم‌زمان هر دو ژن مؤثر در حدت در جدایه‌های شتر‌مرغ‌های به ظاهر سالم به طور میانگین به میزان 2/18 درصد و در جدایه‌های طیور مبتلا به کلی‌باسیلوز برابر با 1/11درصد می‌باشد که اگر چه نتایج، نشان دهنده بیشتر بودن فراوانی هم‌زمان دو ژن در جدایه‌های شتر‌مرغ‌های به ظاهر سالم از موارد کلی‌باسیلوزی می‌باشد، اما بین این دو تفاوت معنی‌داری مشاهده نشد. مطالعاتی در این زمینه، بویژه در مورد شترمرغ، براساس بررسی منابع موجود، یافت نشد تا نتایج مطالعه حاضر در منطقه با سایر مناطق ایران مقایسه شود. Kafshdouzan و همکاران  در سال 2012 در بررسی توزیع ژن‌های مرتبط با حدت در اشریشیاکلی جدا‌شده از طیور مبتلا به کلی‌باسیلوز به این نتیجه رسیدند که 85 درصد سویه‌های اشریشیاکلی حداقل یکی از ژن‌های حدت را دارند، در‌حالی‌که 66 درصد از سویه‌های اشریشیاکلی جدا‌شده از پرندگان به ظاهر سالم برای حداقل یک ژن حدت مثبت در نظر گرفته شدند (24). نتایج تحقیق حاضر، باز هم نشان دهنده بکارگیری عواملی، غیر از ژن‌های مورد مطالعه در تحقیق حاضر، در جدایه‌های اشریشیا کلی شترمرغ برای ایجاد بیماری است که نیاز به بررسی ژن‌های حدت بیشتری در این جدایه‌ها ضروری به نظر می‌رسد.

نتیجهگیری: با توجه به تحقیق حاضر به نظر می‌رسد با توجه به فراوانی آماری یکسان دو ژن iss و bor بین شترمرغ‌های به ظاهر سالم و طیور مبتلا به کی‌باسیلوز احتمالاًً مکانیزم‌های بیماریزایی باکتری در گونه‌های متفاوت با یکدیگر اختلاف دارند و برای تشخیص بیماری کلی‌باسیلوز در شتر‌مرغ نسبت به طیور کلی‌باسیلوزی، ژن bor مشابه ژن iss کارایی زیادی در منطقه مورد مطالعه نخواهد داشت. عوامل بیماریزا تأثیر کم‌تری روی شتر‌مرغ دارد یا این که عوامل حدت دیگری در  بیماریزایی باکتری در این موجود نقش دارند. به علاوه، می‌توان شتر‌مرغ را به عنوان منبعی برای جابجایی ژن bor بین طیور در منطقه مورد مطالعه در نظر گرفت و احتمالاً جدایه‌های اشریشیا کلی شترمرغ، عواملی، غیر از ژن‌های مورد مطالعه در تحقیق حاضر را برای ایجاد بیماری در شترمرغ به کار می‌گیرند که این مطلب نیاز به بررسی ژن‌های حدت بیشتری در این جدایه‌ها دارد.

 

تشکر و قدردانی

این تحقیق به عنوان بخشی از پایان نامه جهت اخذ درجه دکتری عمومی دامپزشکی (خانم افسانه حسینی) به انجام رسیده است (شماره ثبت 10432). بدین وسیله از مسئولین محترم معاونت پژوهشی دانشگاه زابل و کارشناسان محترم آزمایشگاه میکروبیولوژی دانشکده دامپزشکی بویژه سرکار خانم سرگلزایی و جناب آقای سعید شهریاری قدردانی و سپاسگذاری می‌شود.

 

تعارض در منافع

بین نویسندگان  هیچ گونه تعارض در منافع  گزارش نشده است.

 

Abd El Tawab, A. A., Maarouf, A. A. A., Abd El Al, S. A., El Hofy, F. I., El Mougy, E. E. A. (2014). Detection of some virulence genes of avian pathogenic E.coli by polymerase chain reaction. Benha Vet Med J, 26 (2), 159-176.

Arabi, S., Jafarpour, M., Mirinargesi, M., Asl, S. B., Naghshbandi, R., Shabanpour, M. (2013). Molecular characterization of Avian Pathogenic Escherichia coli in broilers bred in Northern Iran. Glob Vet, 10(4), 382-386. https://doi.org/10.5829/idosi.gv.2013.10.4.72117

Barondess, J. J., Beckwith, J. (1990). A Bacterial virulence determant encoded by lysogenic coliphage λ. Nature, 346 (6287), 871-874. https://doi.org/10.1038/346871a0 PMID: 2144037

Barondess, J. J., Beckwith, J. (1994). bor gene of phage λ, involved in serum resistance, encodes a widely conserved outer membrane lipoprotein. J Bactriol, 177(5), 1247-1253. https://doi.org/10.1128/jb.177.5.1247-1253.1995

Bejaei, M., Cheng, K. M. (2014). A survey of current ostrich handling and transport practices in North America with reference to ostrich welfare and transportation guidelines set up in other countries. Poult Sci, 93(2), 296-306. https://doi.org/10.3382/ps.2013-03417 PMID: 24570450

Binns, M. M., Davis, L. D., Hardy, G. K. (1979). Cloned fragments of the plasmid Col V, I-K94 specifying virulence and serum resistance. Nature, 279(5716), 778-781. PMID: 377103

Delicato, E. R., de Brito, B. J., Gaziri, L. C. J., Vidotto, M. C. (2003). Virulence associated genes in Escherichia coli isolates from poultry with colibacillosis. Vet Microbiol, 94(2), 97–103. https://doi.org/10.1016/S0378-1135(03)00076-2. PMID: 12781478.

Derakhshandeh, A., Zahraei Salehi, T., Muniesa, M. (2011). Expression and analysis of the complement resistant trait Iss, from E.coli strain χ1378 isolated from poultry colibacillosis in Iran. J Vet Res, 12(4), 241-245. https://doi.org/10.22099/ijvr.2011.78

Derakhshandeh, A., Zahraei Salehi, T., Tadjbakhsh, H., Karimi, V. (2009). Identification, cloning and sequencing of Escherichia coli strain χ1378 (O78:K80) iss gene isolated from poultry colibacillosis in Iran. Lett Appl  Microbiol, 49 (3), 403–407. https://doi.org/10.1111/j.1472-765X.2009.02681.x PMID: 19622075

Dias da Silveira, W., Ferreira, A., Brocchi, M., Maria de Hollanda, L., Pestana de Castro, A. F., Tatsumi Yamada, A., Lancellotti, M. (2002). Biological characteristics and pathogenicity of avian Escherichia coli strains. Vet Microbiol, 85(1), 47-53. https://doi.org/10.1016/10.1016/S0378-1135(01)00482-5 PMID: 11792491

Dou, X., Gong, J., Han, X., Xu, M., Shen, H., Zhang, D., Zhuang, D., Liu, J., Zou, J. (2015). Characterization of avian pathogenic Escherichia coli isolated in eastern China. Gene, 576(1 Pt 2), 244–248. https://doi.org/10.1016/j.gene.2015.10.012 PMID: 26475938

Holmes, D. S., Quigley, M. (1981). A rapid boiling method for the prepration of bacterial plasmids. Anal Biochem, 114 (1), 193-197. PMID: 6269464

Huchzermeyer, F. W. (1997a). Animal health risks associated with ostrich products. Rev Sci Tech, 16(1), 111-6. PMID: 9329111

Huchzermeyer, F. W. (1997b). Public health risks of ostrich and crocodile meat. Rev Sci Tech, 16(2), 599-604. PMID: 9501374

Huchzermeyer, F. W. (2002). Diseases of farmed crocodiles and ostriches. Rev Sci Tech, 21(2), 265-76. PMID: 11974614

Huja, S., Oren, Y., Trost, E., Brzuszklewicz, E., Biran, D., Blom, J.,  Goesmann, A., Gottschalk, G., Hacker, J., Ron, E. Z., Dobrindt, U. (2015). Genomic avenue to avian coliseptisemia. MBio, 6(1), e01681-14. https://doi.org/10.1128/mBio.01681-14 PMID: 25587010

Jeong, Y. W., Kim, T. E., Kim, J. H., Kwon, H. J. (2012). Pathotyping avian pathogenic Escherichia coli strains in Korea. J Vet Sci, 13 (2), 145-152. https://doi.org/10.4142/jvs.2012.13.2.145 PMID: 22705736

Johnson, J. T., Johnson, J. S. Nolan, L. K. (2006a). Complete DNA sequence f a ColBM plasmid from avian pathogenic Escherichia coli suggests that it evolved from closely related ColV virulence plasmids. J Bacteriol, 188(16), 5975-5983. https://doi.org/10.1128/JB.00204-06 PMID: 16885466

Johnson, J. T., Siek, K. E., Johnson, S. J. Nolan, L. K. (2006b). DNA sequence of a ColV plasmid and prevaleance of selected plasmid encoded virulence genes among avian Escherichia coli strains. J Bacteriol, 188 (2), 745-758. https://doi.org/10.1128/JB.188.2.745-758.2006 PMID: 16385064

Johnson, J. T., Wannemuehler, Y. M., Doetkott, C., Johnson, J. R., Kim, K. S., Spanjaard, L., Nolan, L. K. (2008a). Comparison of extraintestinal pathogenic Escherichia coli strains from human and avian sources reveals a mixed subset representing potential zoonotic pathogens. Appl Environ Microbiol, 74(22), 7043-50. https://doi.org/10.1128/AEM.01395-08 PMID: 18820066

Johnson, J. T., Wannemuehler, Y. M., Doetkott, C., Johnson, S. J., Rosenberger, S. C., Nolan, L. K. (2008b). Identification of minimal predictors of avian pathogenic Escherichia coli virulence for use as a rapid diagnosis tool. J Clin Microbiol, 46(12), 3987-3996. https://doi.org/10.1128/JCM.00816-08 PMID: 18842938

Johnson, J. T., Wannemuehler, Y. M., Nolan, L. K. (2008c). Evolution of the iss gene in Escherichia coli. Appl Environ Microbiol, 74(8), 2360-2369. https://doi.org/10.1128/AEM.02634-07

Joiner, K. A. (1998). Complement evasion by bacteria and parasites. Ann Rev Microbiol, 42, 201-203. https://doi.org/10.1146/annurev.mi.42.100188.001221 PMID: 3059994

Kafshdouzan, Kh., Zahraei Salehi, T., NayeriFasae, B., Madadgan, O., Yamasaki, Sh., Hinenoya, A., Yasuda, N. (2012). Distribution of virulence associated genes in isolated Esherichia coli from avian colibacillosis. Iran J Vet Med, 7(1), 1-6, https://doi.org/10.22059/ijvm.2013.32017

Khoshkhoo, P. H. and Peighambari, S. M. (2005). Drug resistance patterns and plasmid profiles of E.coli isolated from cases of avian colibacillosis. Journal of Veterinary Research, 60(2), 97-105.

Knobl, T., Baccaro, M. R., Moeno, A. M., Gomes, T. A. T., Vieira, M. A. M., Ferreira, C. S. A., Piantino Ferreira, A. J. (2001). Virulence properties of Escherichia coli isolated from ostriches with respiratory disease. Vet Microbiol, 83(1), 71-80. https://doi.org/10.1016/S0378-1135(01)00403-5 PMID: 11524167

Li, Y., Chen, L., Wu, X., Huo, S. (2015). Molecular characterization of multidrug-resistant avian pathogenic Escherichia coli isolated from septicemic broilers. Poult Sci, 94(4), 601-611. https://doi.org/ 10.3382/ps/pev008 PMID: 25667425

Lutful Kabir, S. M. (2010). Avian colibacillosis and salmonelosis: A closer look at epidemiology, pathogenesis, diagnosis, control and public health concerns. Int J Environ Res Public Health, 7(1), 89-114. https://doi.org/10.3390/ijerph7010089 PMID: 20195435

Lynne, A. M., Foley, S. L., Nolan, L. K. (2006a). Immune response to recombinant Escherichia coli iss protein in poultry. Avian Dis, 50(2), 6-273. https://doi.org/10.1637/7441-092105R.1. PMID: 16863080.

Lynne, A. M., Skyberg, J. A., Logue, C. M., Doerkott, C., Foley, S. L., Nolan, L. K. (2007). Characterization of a series of transconjugant mutants of an avian pathogenic Escherichia coli isolate for resistance to serum complement. Avian Dis, 51(3), 771-776. https://doi.org/10.1637/0005-2086(2007)51[771:COASOT]2.0.CO;2 PMID: 17992940

Lynne, A. M., Skyberg, J. A., Logue, C. M., Nolan, L. K. (2006b). Detection of Iss and Bor on the surface of Escherichia coli. J  Appl Microbiol, 102(3), 660–666. https://doi.org/10.1111/j.1365-2672.2006.03133.x PMID: 17309614

Mohamadi, E., Alizade, H., Askari, N., Salehi, M., Porjafarian, M., Ghanbarpour, R. (2015). Antibiotic resistance profile in relation to phylogenetic ackground in Escherichia coli isolated from fecal samples of healthy ostriches. International Journal of Enteric Pathogens, 3(2), e25366. https://doi.org/10.17795/ijep25366

Nolan, L. K., Horne, S. M., Gidding, C. W., Foley, S. L., Johnson, T. J., Lynne, A. M., Skyberg, J. (2003). Resistance to serum complement, iss, and virulence of avian Escherichia coli. Vet Res Commun, 27(2), 101-110. https://doi.org/10.1023/A:1022854902700 PMID: 12718504

Nolan, L. K., Wooley, R.E., Cooper, R.K. (1992). Transposon mutagenesis used to study the role ofcomplement resistance in the virulence of an avian Escherichia coli. Avian Dis, 36(2), 398-402. https://doi.org/10.2307/1591519 PMID: 1320868

Ohadi, H., Haji Babaei, A., Ghaffori, S. A. (2006). Breeding and Diseases of Ostriches and Other-Related Birds. (1st ed.) Parto-Vaghe in collaboration with Danensh-Negar.Tehran, Iran. p. 71-75.

Reed, K. D., Meece, J. K., Henkel, J. S., Shukla, S. K. (2003). Birds, migration and emerging zoonoses: west nile virus, lyme disease, influenza A and enteropathogens. Clin Med Res, 1(1), 5-12. https://doi.org/10.3121/cmr.1.1.5. PMID: 15931279

Rezaei Far, A., Peighambari, S. M., Sadrzadeh, A., Askari Badouei, M. (2013). Bacterial contamination of dead-in-shell embroys in ostrich hatcheries and antimicrobial resistance petterns of isolated Escherichia coli. Iran J Vet Med, 7(3), 169-175. https://doi.org/10.22059/ijvm.2013.35967

Rodriguez-siek, K.E., Giddings, C.W., Doetkott, C., Johnson, T.J., Nolan, L.K. (2005). Characterizing the APEC pathotype. Vet Res, 36(2), 241-256. https://doi.org/10.1051/vetres:2004057 PMID: 15720976

Salari, S., Zahraei Salehi, T., Nayeri Fasaei, B., Karimi, V. (2014). Construction of an iss deleted mutant strain from a native avian pathogenic Escherichia coli O78: K80 and in vitro serum resistance evaluation of mutant. Iran J Vet Med, 8(1), 1-8. https://doi.org/10.22059/ijvm.2014.50556

Schouler, C., Schaeffer, B., Bree, A., Mora, A., Dahbi, G., Oswald, F. B. E., Mainil, J., Blanco, J., Moulin – Schouleur, M. (2012). Diagnostic strategy for identifying avian pathogenic Escherichia coli based on four patterns of virulence genes. J Clin  Microbiol, 50(5), 1673–1678. https://doi.org/10.1128/JCM.05057-11 PMCID: PMC3347144

Stewart, J. (2013). Ratites. In: Ritchie, B.W., Harrison, G. J., Harrison, L. R. (eds.), Avian Medicine- Principles and Application. Wingers Publishing Inc. Lake Worth, FL, USA. p. 1285-1326.

Tobias, F. L., Nunes Garcia, L. N., Masahiko Kanashiro, M.,  Medina-Acosta, E., Gato Brom-de-Luna, J.,Costa de Almeida, C. M., Azevedo Junior, R. R., Lemos, M., Vieira-da-Motta, O. (2012). Growth inhibition of Staphylococcus aureus and Escherichia coli strains by neutralizing IgY antibodies from ostrich egg yolk. Braz J Microbiol, 43(2), 544–551. https://doi.org/10.1590/S1517-83822012000200015 PMID: 24031862

Verwoerd, D. J. (2000). Ostrich diseases. Rev Sci Tech, 19(2), 638-661. PMID: 10935285

Wen-jie, J., Zhi-ming, Z., Yong-zhi, Z., Ai-jian, Q., Hong-xia, S., Yue-long, L., Jiao, W., Qian-qian, W. (2008). Distribution of virulence-associated genes of avian pathogenic Escherichia coli isolates in China. Agric Sci China, 7(12), 1511-1515. https://doi.org/10.1016/S1671-2927(08)60410-1

Zahraei Salehi, T., Shayegh, J. (2008). Veterinary Microbiology and Microbial Diseases (Bacterial Pathogens). (2nd ed.) Univerity of Tehran Press. Tehran, Iran. p. 185.

Zahraei Salehi, T., Derakhshandeh, A., Tadjbakhsh, H., Karimi, V. (2013). Comparison and phylogenetic analysis of the ISS gene in two predominant avian pathogenic Escherichia coli serogroups isolated from avian colibacillosis in Iran. Res Vet Sci, 94(1), 5–8. https://doi.org/10.1016/j.rvsc.2012.07.010 PMID: 22854600