بررسی تغییرات هیستوپاتولوژیک به دنبال تجویز پلاسمای غنی از پلاکت (PRP) در محل برداشت سر استخوان فمور در خرگوش

نوع مقاله: جراحی، هوشبری و بیماری های اندام حرکتی

نویسندگان

1 دانش آموخته، دانشکده دامپزشکی دانشگاه سمنان، سمنان، ایران

2 گروه پاتوبیولوژی، دانشکده دامپزشکی دانشگاه سمنان، سمنان، ایران

3 دانش‌آموخته جراحی دامپزشکی، دانشکده دامپزشکی دانشگاه تهران، تهران، ایران

چکیده

زمینۀ مطالعه: برداشت سر استخوان فمور در شکستگی­ها یا بیماری­های دژنراتیو به عنوان یک جراحی حمایتی بوده و  ایجاد فیبروز و ترمیم در ناحیه جراحی معمول است. کوتاهی دوره ترمیم و ایجاد حداقل بافت فیبروزه و جایگزینی آن با بافت استخوان کمک موثری در بازگشت حیوان به شرایط سلامت می‌نماید.
هدف: هدف تحقیق مطالعه تغییرات هیستوپاتولوژیک ایجاد شده بعد از تجویز پلاسمای غنی از پلاکت در محل برداشت سر فمور در خرگوش بوده است.
روش‌کار: 20 سر خرگوش  سفید نیوزیلندی در دو گروه مساوی شامل گروه‌ کنترل (برداشت سر استخوان فمورFHO ) و گروه تیمار (FHO همراه با قرار دادن پلاسمای غنی از پلاکت  PRP)  توزیع شدند. در هر دو گروه بعد از انجام بیهوشی عمومی با استفاده از رهیافت کرانیولترال نسبت به تروکانتر بزرگ، سر استخوان فمور برداشته شد. در گروه تیمار  PRPاتولوگ در محل جراحی به عنوان بستر قرار گرفت. حیوانات بعد از هشت هفته یوتانایز شده و استخوان فمور از ناحیه راسی  به طول 2 سانتی‌متر همراه با بافت‌های ترمیمی اطراف ناحیه جدا شده و از محل ترمیم هر کدام از نمونه‌ها مقاطع میکروسکوپی تهیه شده و با هماتوکسیلین₋ائوزین و  ماسون تری‌کروم رنگ‌آمیزی شدند. پس از مقایسه و ثبت تغییرات کیفی در ناحیه جراحی، با استفاده از اسکن­های با بزرگ نمایی 50 برابر نسبت تشکیل بافت­های جوانه گوشتی به غضروف، جوانه گوشتی به استخوان و غضروف به استخوان محاسبه شد.
نتایج: در گروه تیمار تشکیل بافت­های غضروف و استخوان در روند ترمیم از نظم  و یک­پارچگی بیشتری برخوردار بود. نسبت تشکیل بافت غضروف به بافت جوانه گوشتی و نسبت تشکیل بافت استخوان به بافت جوانه گوشتی در گروه PRP در مقایسه با گروه کنترل به طور معنی­داری بیشتر بود. این موضوع نشانگر گرایش بیشتر به استخوانی شدن و سرعت بیشتر در ترمیم ناحیه آسیب در گروه 2 است.
نتیجه‌گیری نهایی: استفاده از پلاسمای غنی از پلاکت باعث افزایش نظم و تسریع در روند ترمیم بافت استخوانی برداشت شده در راس استخوان فمور خرگوش گردید. به نظر می­رسد بتوان استفاده از PRP را به عنوان یک پروتکل درمانی جهت تسریع در ترمیم بافت استخوانی برداشت شده در این موارد پیشنهاد نمود.

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Histopathological Changes Following Administration of Platelet-rich Plasma (PRP) in Femoral Head Osteotomy (FHO) in Rabbit

نویسندگان [English]

  • Roghieh Bakhtooh 1
  • Abbas Javaheri Vayeghan 2
  • Nooshin Ghazale 3
  • Sahar Ghaffari Khaligh 2
1 Graduated from the Faculty of Veterinary Medicine, Semnan University, Semnan, Iran
2 Department of Pathobiology Faculty of Veterinary Medicine, Semnan University, Semnan, Iran
3 Graduated from the Clinical Science, Faculty of Veterinary Medicine, Tehran University, Tehran, Iran
چکیده [English]

BACKGROUND: Femoral head osteotomy in cases of fractures or degenerative diseases is as a routine surgical procedure. Less duration of the healing period and the creation of minimal fibrous tissue and its replacement with bone tissue can be effective in return to health.
OBJECTIVES: The aim of this study was to evaluate the histopathological changes following administration of platelet-rich plasma at the site of  removed femoral head in rabbits.
METHODS: Twenty male New Zealand white rabbits were distributed into two groups including: control (underwent femoral head osteotomy, FHO) and treatment (underwent FHO and planting the platelet-rich plasma on surgical site FHO₊ PRP). In both groups after general anesthesia, femoral head was removed using standard method. In group 2, pre-prepared auto log PRP was used at the site of surgery. After eight weeks all animals were euthanised, femur and its  surrounding healing tissues were cut 2cm  far from the head of femur and removed. Slides were prepared from each sample  through serial sectioning and were stained with H&E and Mason Trichrome. Qualitative changes such as granulation tissues, cartilage and bone formation and their organization and timeliness, thickness of collagen fibers and cellular changes were compared. To quantify the changes, whole surface of the Mason Trichrom stained samples underwent scan with ×50 magnifications and then area of different new formation tissues was measured. Average occupancy levels of each tissue, their ratio to whole surface of sample and to each other in two groups were calculated and compared.
RESULTS: In PRP treated group ratio of cartilage tissue to granulation tissue and formation of bone to granulation tissue is significantly more than these parameters in control group. Results indicate faster healing on the damaged area in group 2. Also in group 2, cartilage and bone tissues formation in the healing process was more orderly.
CONCLUSIONS: PRP could accelerate healing of bone tissue that is cut at the head of the rabbit’s femur. So it seems that the use of PRP as a treatment protocol in these cases could be suggested.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Rabbit
  • Platelet
  • Femur
  • Healing
  • Histopathology

مقدمه

 

شایع‌ترین اندیکاسیون‌های جراحی برداشت سر استخوان فمور یا Femoral Head Ostectomy ، بیماری‌های دژنراتیو مفصلی ناشی از دیسپلازی، آرتروز‌های مزمن، شکستگی‌هایComminuted حفره استابولوم و یا گردن استخوان فمور، شکستگی‌های سر استخوان فمور، دررفتگی‌های مزمن مفصل لگنی رانی همراه با اروزیون سر استخوان فمور هستند. این روش اغلب نخستین انتخاب درمانی برای حیوان خانگی بالغ و همچنین درمان بیماری legg-calve-perthes در کودکان است (4،20). از این روش بیشتر در مواردی که محدودیت‌های مالی مانع بازسازی‌های گران قیمت ارتوپدی است استفاده می‌شود. دیگر اندیکاسیون‌های معمول این جراحی شامل: عدم پاسخ درمانی مناسب در تعویض کامل مفصل لگنی رانی، نکروز سر استخوان فمور، آرتریت­های شدید مفصلی و تشکیل انتزوفیت­های استخوانی (8) است. به طور خلاصه، این روش مناسب شرایطی است که در آن یکپارچگی مفصل به خطر افتاده و ترمیم اولیه امکان‌پذیر نیست و یا استئوآرتروز شکل گرفته است (4). دراین جراحی سر استخوان فمور از ناحیه اناتومیک بالاتر از گردن برداشت می‌شود. بعد از آن عملکرد اندام با تشکیل بافت فیبروزه متراکم و همچنین حرکت به سمت استخوانی شدن محل برش و ایجاد مفصل کاذب در محل برداشت شده استخوان ادامه می‌یابد. به این ترتیب با برداشته شدن عامل محرک و کاهش درد، بهبود مانور حرکتی مفصل و افزایش حرکت اندام میسر می‌گردد. بیماران بعد از جراحی FHO درجات کمی از کوتاهی اندام و اختلالات حرکتی را دارند ولی با انجام توانبخشی مستمر می‌توانند به زندگی فعال خود برگردند (20). استفاده از مواد محرک جهت تقویت و تسریع رشد بافت جبرانی در محل می‌تواند در بازگشت به وضعیت حرکتی نرمال مؤثر باشد (9). امروزه مطالعات گسترده‌ای بر روی محصولات خونی اتولوگ مانند Platelet-rich plasma (PRP) که از خون خود بیمار تهیه می‌شود در جهت  تلاش برای استفاده از اثرات مفید این فاکتورهای رشد در تقویت ترمیم بافتی انجام می‌شود .این تلاش ها بر پایه توانایی پلاکت ها در آزاد سازی فاکتور های رشد از گرانول های الفا آنهاست که نقش مهمی را در میانجی‌گری پروسه ترمیم بافتی ایفا می‌کنند. (3). پلاسمای غنی از پلاکت می تواند به عنوان منبعی از میانجی های شیمیایی در طی بروز التهاب عمل کرده و فاکتورهای رشد را آزاد ‌کند (21). در این تحقیق با توجه به حضور تنوع قابل توجهی از فاکتورهای رشد در پلاکت­ها، جهت تسریع در روند ترمیم بافت تحت جراحی از افزودن پلاسمای غنی از پروتئین (PRP) در ناحیه استفاده شده است. در روند ترمیم استخوان­ ارزیابی میزان و سرعت تشکیل رشته­های کلاژن و سازمان­یابی و پلیمریزاسیون این رشته­ها می­تواند برای درک سرعت ترمیم تعیین کننده باشد لذا برای مقایسه گروه­ها از جهت حجم و میزان تراکم و میزان سازمان­یابی رشته­های کلاژن و درک روند تبدیل کلاژن به غضروف و تبدیل غضروف به استخوان از  رنگ­آمیزی ماسون­تری­کروم استفاده شد.

مواد و روش­ کار

مدل حیوانی: برای انجام این تحقیق20 سر خرگوش نر سفید نیوزلندی با وزن 5/0 ± 2 کیلوگرم به 2 گروه کنترل یا تحت جراحی برداشت سر استخوان فمور (FHO) و گروه تیمار یا تحت جراحی برداشت سر استخوان فمور همراه با استفاده از PRP تقسیم شدند. به منظور پرهیز از استرس و سازگار شدن حیوانات با محیط به مدت 10 روز هیچگونه آزمایشی روی خرگوش ها صورت نگرفت. پروتکل این مطالعه مطابق اصول اخلاقی مورد تائید کمیته های بین المللی حمایت از حقوق حیوانات آزمایشگاهی انجام گرفت.

 تهیه PRP : پلاسمای غنی از پلاکت مورد نیاز با استفاده از 10 میلی­لیتر از خون سیتراته هر حیوان و بعد از 2 مرحله سانتریفیوژ  و استفاده از میزان لازم گلوکونات کلسیم  طبق دستورالعمل  Dhurat
(7) به صورت ژل تهیه شد.

روش جراحی: در روز عمل، پس از کاتتر گذاری وریدی القا بیهوشی با ترکیبی از داروهای کتامین هیدروکلراید با دوز mg/kg 60 و مدتومیدین هیدروکلراید با دوز mg/kg 25/0 انجام گردید. در ادامه آماده سازی آسپتیک و شان گذاری در ران پای راست انجام گرفت. پس از شروع بیهوشی، برای دسترسی به مفصل لگنی، با استفاده از رهیافت قدامی- جانبی (Cranio-lateral)  برشی به طول 10 سانتی متر در پوست داده شد. پس از کنار زدن عضلات دو سر ران و کشندۀ نیام پهن و برش عضلۀ پهن بیرونی، کپسول مفصل رانی مشخص گردید. پس از برش کپسول مفصلی و جهت دسترسی به سر و گردن استخوان ران، رباط گرد بریده شد. در ادامه و با استفاده از استخوان بر، برش را از زیر تروکانتر بزرگ به سمت گردن فمور روی یک خط ادامه دادیم و کورتکس داخلی فمور بدون برجای‌گذاشتن زاویه تیز، از وسط قطع گردید. محل جراحی با نرمال سالین استریل به خوبی شستشو و ساکشن شد. در گروه تیمار میزان 2 سی سی ژل PRP در محل برداشت شده استخوانی به عنوان بستر قرار داده شد و در گروه کنترل  نیز موضع جراحی با میزان 2 سی سی نرمال سالین پر گردید. در نهایت کپسول مفصلی، عضلات و پوست به روش روتین بخیه شد. در طی دوره پس از جراحی از داروی انروفلوکساسین به میزان mg/kg 5 بصورت زیر جلدی و به مدت 5 روز استفاده شد. حضورتورم یا التهاب احتمالی در ناحیه، باز شدن بخیه ها و حضور ترشحات یا عفونت های احتمالی موضع به صورت مستمر بررسی گردید.

نمونه گیری و ارزیابی هیستوپاتولوژی: حیوانات تحت آزمایش بعد از طی 8 هفته‌ دوره نقاهت یوتانایز شدند و سپس محل جراحی باز شده و سر فمورها از فاصله 2 سانتی متری از انتها به همراه بافت­های ترمیمی اطراف جدا گردیده و در محلول فرمالین بافر 10% قرار داده شدند. پس از تثبیت، دکلسیفیه شدن و طی مراحل آماده سازی از هر نمونه چندین برش با ضخامت 5 میکرون تهیه شد. نیمی از برش ها از هر نمونه با روش H&E و نیمی دیگر برای تشخیص تفریقی رشته های کلاژن با روش­ ماسون­تری­کروم رنگ شدند. برای اندازه‌گیری وسعت هر بخش از بافت‌های ترمیمی ابتدا با استفاده از دستگاه اسکنر لام (850Opticlab H) از مقاطع میکروسکوپی رنگ‌آمیزی شده با ماسون تری کروم اسکن با بزرگنمایی 50 برابر تهیه شده و سپس با استفاده از نرم‌افزار  Axiovision LE همزمان با مشاهده میکروسکوپی، میزان تشکیل هر بافت در هر نمونه بر مبنای تعداد واحد(پیکسل) اشغال شده در تصویر توسط بافت مورد نظر به طور جداگانه اندازه‌گیری و ثبت شد. سپس نسبت تشکیل بافت­های جوانه گوشتی به غضروف، جوانه گوشتی به استخوان و غضروف به استخوان در هر نمونه محاسبه شد. ارتباط بین نتایج این محاسبات به عنوان داده­های خام با استفاده از نرم افزارSigma Stat  و آزمون  T Test مورد ارزیابی آماری قرار گرفت.

نتایج

در مشاهدات میکروسکوپی ضمن وجود تشابه کلی در مراحل ترمیم در بین کلیه نمونه­ها، تفاوت­های قابل توجهی نیز بین دوگروه کنترل و گروه تیمار قابل تشخیص بود. در تمام نمونه­ها در رنگ آمیزی با هماتوکسیلین و ائوزین تشکیل بافت­های جوانه گوشتی، غضروف و استخوان کاملا قابل مشاهده بود و در هیچکدام از نمونه­ها آثاری از بروز التهاب مشاهده نشد. در تمام نمونه ها ترتیب غالب در بروز ترمیم عبارت بود از تشکیل توده قابل توجهی از جوانه گوشتی که توده غضروفی در حال رشد را احاطه کرده و در ادامه نیز تشکیل و گسترش ترابکول­های استخوانی از بخش­های بالغ توده غضروفی به سمت مغز استخوان مشاهده می­شد. در مقایسه بین دو گروه مراحل ابتدایی ترمیم شامل ادم بافت بینابینی، تشکیل عروق خونی جدید، تشکیل رشته های کلاژن به صورت رشته­های باریک در گروه کنترل بیشتر از گروه تیمار بود. در حالی که در گروه تیمار با وجود حجم کمتر بافت جوانه گوشتی، رشته­ها­ی کلاژن پلیمریزاسیون بیشتری از خود نشان می­دادند. در نمونه­های این گروه میزان ادم و حضور عروق تازه تشکیل کمتر از گروه یک بود. در نمونه­های رنگ­آمیزی شده با ماسون­تری­کروم نیز در گروه تیمار ضخامت رشته های کلاژن و میزان همسوئی بین این رشته­ها و سازمان­یابی آن­ها در مناطق متناظر  با گروه یک چشمگیرتر بود. در این رنگ­آمیزی رشته­های کلاژن به رنگ سبز دیده می­شوند و در هر زمینه از بافت تراکم و گستردگی رنگ سبز نشان­دهنده  حضور و سازمان­یابی بیشتر این رشته­ها است (تصاویر1و2). در گروه تیمار روال تشکیل بافت غضروفی با حضور کندروبلاست­ها و به تدریج با تکامل آن­ها به شکل کندروسیت و به دنبال آن تشکیل بافت استخوانی از توالی و نظم بیشتری برخوردار بود و تشکیل این بافت­ها کاملا در جایگاه­های مورد انتظار از نظر فیزیولوژیک انجام گرفته و مراحل میتوز و تمایز سلول­های غضروفی به صورت پی در پی تا تشکیل استئوبلاست­ها قابل مشاهده بود (تصویر3) . در حالی که در گروه کنترل موارد متعددی از بی­نظمی مانند حضور کانون­های متعدد و بی­نظم غضروفی در داخل بافت جوانه گوشتی  و حضور کانون­های در حال استخوانی شدن در داخل توده غضروفی و همچنین حضور تود­ه غضروفی در بین ترابکول­های استخوانی (تصویر4) و  تفاوت قابل توجه در حجم و نسبت توده­های غضروفی و استخوانی به یکدیگر در نمونه­های مختلف این گروه و محل­های مختلف هر نمونه مشاهده می­شد. این موضوع تا حدزیادی باعث افزایش حجم توده ترمیمی در نمونه­های گروه کنترل بود. با پیشرفت به سمت مرکز استخوان نیز تمایز استئوبلاست­ها و تشکیل ترابکول­های استخوانی به شکل جوان و در حال بلوغ و کلسیفیکاسیون استخوانی و بالاخره  تبدیل استئوبلاست­ها به استئوسیت­ها مشاهده می­شد. گستردگی سطح اشغال مغز استخوان توسط تیغه­های استخوانی و همچنین ضخامت تیغه­ها در گروه تیمار در مقایسه با  گروه کنترل (تصاویر 5 و 6) بیشتر بود. متناسب با ضخامت و طول بیشتر تیغه­های استخوانی در گروه تیمار تغییر رنگ غضروف­ها از رنگ سبز به رنگ قرمز که نشان دهنده کلسیفیکاسیون استخوانی در رنگ­آمیزی تری­کروم است در گروه تیمار بیشتر مشاهده می­شد.

مقایسه کمی نتایج:  نتایج اندازه­گیری­­ها نشان داد که نسبت تشکیل جوانه گوشتی به کل بافت ترمیمی در نمونه­های کنترل بیشتر و نسبت تشکیل بافت غضروفی و بافت استخوانی به کل بافت ترمیمی در این گروه کمتر از نمونه­های گروه تیمار بوده و در هر دو مورد بین این دو گروه اختلاف آماری معنی داری وجود دارد(05/0 P<) (نمودار1). همچنین نسبت تشکیل جوانه گوشتی به غضروف و نسبت تشکیل جوانه گوشتی به استخوان در گروه کنترل بیشتر از گروه تیمار بوده و در این مورد بین نمونه­های این دو گروه اختلاف آماری معنی­داری وجود دارد(05/0 P<). در مقایسه نسبت تشکیل غضروف به استخوان در بین دو گروه مشاهده شد که این نسبت در گروه کنترل بدون وجود اختلاف آماری معنی­دار بالاتر از گروه دو بود (نمودار2).

بحث

 

استفاده از پلاسمای غنی از پلاکت (PRP ) جهت تسریع در روند ترمیم در زمینه­های مختلف جراحی از جمله جراحی سر و گردن، گوش و حلق، ستون فقرات ، جراحی قلب و عروق،  پیوند فک و صورت، ستون فقرات، ارتوپدی, بیماری‌های متابولیک استخوان و مدیریت ترومبوسیتوپنی در دست تحقیق و در حال پیشرفت به سمت استفاده بالینی است. کاربرد آسانPRP در اعمال کلینیکی و نتایج سودمند آن در بازسازی استخوان، کاهش خونریزی و ترمیم سریع زخم رویکرد‌های درمانی جدیدی را به همراه داشته است. اثرات PRP روی باز سازی استخوان توسط فاکتور‌های رشدی مانند فاکتور رشد مشتق از پلاکت، فاکتور رشد شبه انسولینی و فاکتور رشد تغییر شکل دهنده β اعمال می‌شود. از فاکتور‌های رشد آزاد شده از پلاکت می‌توان به اعضای سوپر خانواده TGF-β و پروتئین‌های مورفوژنیک استخوان(BMPs) اشاره نمود. فاکتورهای رشد TGF-β1,و  BMPsاز سلول‌های بنیادی مزانشیمال آزاد می­شوند و تمایز کندروبلاست‌ها و استئوبلاست‌ها و همچنین تولید ماتریکس جدید استخوان را باعث می‌شوند. PRP حاوی پروتئین‌هایی مانند : فیبرین، فیبرونکتین، ویترونکتین و ترومبوسپوندین است که به عنوان مولکول‌های چسبنده به سلول عمل می‌کنند و برای مهاجرت سلول‌های اپیتلیال ، فیبروبلاست‌ها و استئوبلاست‌ها دارای اهمیت هستند. به صورت منطقی و بر مبنای مطالعات قبلی هر چقدر طی مسیر ترمیم از نظر زمانی کوتاه­تر بوده و حجم بافت­های مبنا (جوانه گوشتی) و بافت واسط (غضروف) در مقایسه با حجم بافت نهایی مورد انتظار کمتر باشد نشان­دهنده انجام هزینه کمتر برای ایجاد ترمیم بهتر است. البته هر کدام از این بافت­ها نیز جهت تبدیل و تمایز به بافت بعدی میبایست به بلوغ کافی رسیده باشند. مانند ایجاد پلیمریزاسیون کافی جهت استحکام در رشته­های کلاژن و تولید لاکوناها در غضروف. مشاهدات میکروسکوپی در این پژوهش نشان دهنده حرکت سریع­تر نمونه­های گروه تیمار در این مسیر بود. تفاوت­های مشاهده شده در سرعت ترمیم بین نمونه­های 2 گروه گویای این واقعیت است که دخالت انجام شده در درمان می­تواند باعث گذر سریع­تر بافت­ها از مراحل لازم برای استخوان سازی و در نهایت تولید سریع­تر استخوان بشود. نتایج آزمون آماری نیز در طی زمان برابر تایید کننده افزایش ساخت بافت استخوانی در گروه تیمار در مقایسه با گروه کنترل بود. این روند با توجه به قرار گرفتن تعداد بسیار زیادی از پلاکت­ها در موضع شکستگی و حضور مقادیر بسیار بالایی از واسطه­های شیمیایی ناشی از پلاکت­ها به صورت اولیه در موضع در گروه تیمار، بروز نوعی تنظیم جدید و تسریع در ترمیم را توجیه پذیر می­سازد. نتایج این تحقیق به طور کلی دلالت بر اثر پلاکت ­ها در تسریع روند ترمیم استخوان و کاهش حجم بافت گرانولاسیون و همزمان افزایش سرعت بلوغ و افزایش حجم  بافت­های غضروفی و استخوانی دارد.

بر اساس مطالعه Nikolidakis در سال2008 غلظت‌ مناسب پلاکت در PRP برای کسب نتیجه مناسب درمانی میزان /Lit 109 × 1200-800 است (15).Pazzini  و همکاران  (2016) و Silva و همکاران (2012) نیز تعداد پلاکت­ها در نمونه‌های مناسب PRP را در همین حدود ذکر کرده­اند (19،22). Tietze و همکاران (2014) در بررسی نتایج بالینی  موارد متعددی از ابتلا به استئوارتریت اظهار داشتند که استفاده از پلاسمای غنی از پلاکت می­تواند در تسریع بازگشت مفصل و استخوان مبتلا به شرایط فیزیولوژیک موثر باشد (24) . Ornetti و همکاران (2014) نشان دادند که استفاده از PRP در بروز استئوارتریت می­تواند باعث تسریع در تکثیر و تمایز کندروسیت­ها ­شود (16).

Choi  و همکاران (2005) نشان دادند که غلظت‌های بالای PRP قابلیت های حیاتی و تکثیر سلول‌های آلوئولار استخوان را تضعیف کرده اما غلظت‌های پایین در این موارد تحریک کننده است (5). همچنین  Arpornmaeklong و همکاران (2004) بیان کردند که اثر PRP  بر تمایز استئوژنیک استئوبلاست‌ها وابسته به دوز بوده و حتی می­تواند مهار کننده باشد (1). این گزارشات از این دیدگاه حمایت می‌کندکه اختلاف در غلظت‌های PRP ممکن است روی تشکیل استخوان تأثیر گذارد. Weibrich و همکاران(2002) غلظت پلاکت اهداکنندگان مختلف را بررسی کردند و نشان دادند که غلظت پلاکت درPRP با تعداد پلاکت در خون کامل فرد دهنده مرتبط و وابسته است (25). در این مطالعه برای تهیه PRP مناسب از روش پیشنهادی Pazzini  و همکاران (2016) استفاده شد و با توجه به  روند تهیه PRP نیز این غلظت رعایت شده است. در نتایج این تحقیق اثر استئوژنیک PRP و تاثیر آن بر افزایش نظم در روند استئوژنز نشان داده شد. Paknejad و همکاران (2012) طی مطالعه­ای نشان دادند که با توجه به آزار حاصل از برداشت استخوان بر روی عضو دهنده و مرتبط با استخوان های اتولوگ به کاربردن پلاسمای غنی از پلاکت روش جایگزین و بالقوه سودمندی به جای متریال اتوژن، آلوژن و اگزوژن در جراحی های ایمپلنت و بازسازی استخوان است (18). برخی مطالعات دیگر نیز قابلیتPRP   را در پیشرفت بازسازی نشان می‌دهند. Simman و همکاران طی مطالعه‌ای (2008) نشان دادند که PRP قادر به سرعت بخشیدن به بهبود زخم‌ها و شکستگی است (23) . نتایج مطالعه حاضر نیز نشان داد که استفاده از PRP باعث افزایش سرعت پلیمریزاسیون کلاژن­ها و تبدیل بافت جوانه گوشتی به غضروف و در نهایت  تشکیل تیغه­های استخوانی و افزایش قطر این تیغه ها در مقایسه با گروه کنترل در مدت زمان مساوی می­شود. همچنین در شرایط برابر میزان کلسیفیکاسیون ترابکول­های تازه تشکیل شده استخوانی در  استفاده از PRP افزایش می­یابد. با توجه به این تغییرات انتظار می­رود که استحکام بافت استخوانی تولید شده در گروه PRP بسیار بیشتر از گروه کنترل باشد. ولی در در مقایسه با نتایج حاصل از مطالعه Simman که افزایش اندازه کال استخوانی را گزارش کرده به نظر می­­رسد با توجه به حضور نظم بیشتر در تشکیل تیغه های استخوانی و رعایت روند فیزیولوژیک استخوان سازی در گروه 2 تشکیل کال استخوانی  در این گروه کمتر از گروه کنترل باشد. Blakytny و همکاران (2004) گزارش کردند که بالاترین غلظت TGF–β در پلاکت‌ها یافت می‌شود. این واسطه شیمیایی بیان پروتئین‌های ماتریکس استخوان را تحریک می‌کند و همچنین فعالیت تحلیل رفتن ماتریکس توسط آنزیم‌هایی مثل متالوپروتئیناز را کاهش می‌دهد. اما در مقایسه با BMPs، TGF–β استخوان سازی نابجا را تحریک نمی‌کند. TGF–β تمایز و تزاید سلول‌های استئوبلاست را القاء می‌کند و بیشتر مانع از شکل‌گیری پیش‌ساز‌های استئوکلاست می­شود و حتی در غلظت‌های بیشتر اثر مهاری روی استئوکلاست‌ها دارد. نتایج مطالعه حاضر نیز نشان می­دهد که استفاده از PRP و  افزایش تراکم پلاکت در محیط ترمیم باعث افزایش سرعت استخوان سازی شده و به نظر می­رسد با توجه به کاهش تشکیل جوانه گوشتی و افزایش نظم در تشکیل بافت­ها  نسبت به گروه کنترل، از تشکیل کال استخوانی اضافه جلوگیری ­کند. تغییر در سرعت استئوژنز در گروه 2 در مقایسه با گروه کنترل باید ناشی از آزاد شدن– β TGF  در موضع باشد(2).

kalbkhani و همکاران (2013) اثر پلاسمای غنی از پلاکت، PRP  اتولوگ را روی استئوآرتریت القایی در مفصل stifle خرگوش با ارزیابی­های رادیولوژیکی بررسی کردند. در این تحقیق در گروه درمانی درجات کمتری از دژنراسیون غضروف، تشکیل استئوفیت و اسکلروز در مقایسه با گروه کنترل در هفته 16 بعد جراحی مشاهده شد و با کاهش شدت استئوآرتریت روند التیام به سوی مفصل نرمال تسریع شد (10). Kamoda و همکاران (2013) اثر PRP در تشکیل استخوان با بررسی تغییرات ایمونوهیستوشیمی پپتید مرتبط با ژن کلسیتونینرا ارزیابی کردند و بیان داشتند که حجم استخوان مشاهده شده در گروه PRP به طور قابل ملاحظه­ای بزرگتر از گروه کنترل در طی هفته های چهار و هشت بود. به نظر می­رسد که PRP باعث پیشرفت تشکیل استخوان شده و به کاهش زمان جوش خوردن در مدل رت­های دارای آرترودزیس ناحیه کمری کمک می­کند (11). Malhotra و همکاران (2015) مطالعه‌ای را با هدف ارزیابی اثر بخشی پلاسمای غنی از پلاکت در درمان عدم جوش خوردگی های پایدار شکستگی استخوان‌های بلند در شکل بالینی انجام دادند. از نتایج این مطالعه نتیجه گرفته شد که PRP درمان بی خطر و مؤثری برای موارد جوش نخوردن  استخوان شکسته است (14). البته مطالعات بیشتری برای بررسی مکانیسم مولکولی این تسریع در روند التیام شکستگی توسط PRP مورد نیاز است. Kruger و همکاران (2012) طی مطالعه‌ای اثرات PRP انسانی را روی مهاجرت و تمایز پروژنیتور‌های ساب‌کندرال انسانی را ارزیابی کردند. رنگ‌آمیزی بافت شناسی پروتئوگلیکان‌ و immunostaining کلاژن تیپ II  نشان داد که پروژنیتور‌های تحریک شده با PRP افزایش قابل توجهی را در تشکیل ماتریکس غضروف در مقایسه با پروژنیتور‌های درمان نشده نشان می دهند. آنالیز بیان ژن‌های بیانگر کندروسیت‌ و بیانگر‌های استئوژنیک ومانند استئوکلسین و پروتئین متصل به اسید چرب نشان داد که PRP  باعث  تحریک توالی تمایز پروژنیتور‌های کندروژنیک انسانی می‌شود. این نتایج نشان داد که PRP انسانی ممکن است مهاجرت و تحریک تمایز کندروژنی سلول‌های پروژنیتور ساب‌کندرال انسانی در شکستگی‌های میکرو را بالا ببرد (12).  Kurikchy و همکاران (2013) اثرات پلاسمای غنی از پلاکت اتولوگ را روی روند ترمیم استخوان مورد ارزیابی قرار دادند. آنالیز‌های هیستومورفیک در رنگ آمیزی باVan Geison از جمله شمارش سلول‌های استخوانی  همراه با اندازه‌گیری قطر استئون و ضخامت لاملار نشان داد که در گروهی که از PRP استفاده شده بود در مقایسه با دیگر گروه‌ها بافت استخوانی همراه با افزایش قابل توجه استئوسیت‌ها به خوبی شکل گرفته که نشان دهنده بلوغ استخوانی است و افزایش مساحت سطح ترابکول‌های استخوانی دیده شد و همچنین قطر استئون با ضخامت لاملار به طور قابل ملاحظه ای در مقایسه با دیگر گروه‌ها افزایش یافته بود (13). Dehghan و همکاران طی مطالعه­ای (2015) نشان دادند که استفاده از PRP به همراه سلول­های بنیادی جدا شده از مغز استخوان میتواند باعث افزایش حجم و سرعت بلوغ بافت کال استخوانی در ترمیم ضایعات استخوانی در سگ گردد (6).  Oryan و همکاران (2012 ) نیز نشان دادند که استفاده هم­زمان ازPRP  انسانی و هیدروکسی آپاتیت در افزایش سرعت ترمیم استخوان در شکستگی­های ایجاد شده به صورت تجربی در استخوان­های طویل خرگوش موثر بوده است (17). نتایج تحقیق حاضر نیز  گویای این مطلب است که استفاده از PRP باعث افزایش در تبدیل انواع بافت­ها به بافت بعدی در توالی مراحل ساخت استخوان و البته با نظم و سازمان دهی بیشتر می­شود. سرعت تمایز سلولی در این مطالعه در گروه 2 نسبت به گروه کنترل افزایش پیدا کرده و سرعت پلیمریزاسیون کلاژن­ها و تبدیل بافت جوانه گوشتی به غضروف و تشکیل تیغه­های استخوانی بیشتر بود. همچنین در نتیجه تکامل بیشتر بافت استخوانی سلول­های استئوسیت بیشتری در مقایسه با استئوبلاست­ها قابل مشاهده بود. بنابر نتایج اندازه گیری­های انجام شده بافت گرانولاسیون ایجاد شده در گروه تحت درمان با PRP در مقایسه.با گروه کنترل از حجم کمتر ولی بلوغ بیشتری برخوردار بود.

نتیجه گیری نهایی: بر اساس نتایج این تحقیق و ارزیابی و مقایسه با نتایج سایر تحقیقات انجام شده در این زمینه، استفاده از پلاسمای غنی از پلاکت توانسته است باعث تسریع در روند ترمیم بافت استخوانی در راس استخوان فمور خرگوش گردد. با توجه به این­که در موارد متعدد بالینی مانندآرتریت­های شدید در حیوانات خانگی ممکن است به عنوان یک پروتکل درمانی نیاز به انجام این برش وجود داشته باشد، به نظر می­رسد در صورت تکرار استفاده از PRP در موارد ابتلا و گزارش نتایج مشابه با نتایج این تحقیق در موارد مکرر بتوان این روش را به عنوان یک پروتکل درمانی جهت تسریع در ترمیم بافت استخوان در عمل مذکور پیشنهاد نمود.

سپاسگزاری

در پایان از معاونت محترم پژوهشی دانشگاه سمنان و مسئولین دانشکده دامپزشکی جهت فراهم نمودن امکان انجام این تحقیق تشکر و قدردانی می­گردد.

تعارض منافع

بین نویسندگان تعارض در منافع گزارش نشده است.

 

 

تصویر 1.  حضور ادم زیاد و رشته­های کلاژن کم، نازک و نامنظم به رنگ سبز در بافت گرانوله در گروه کنترل. رنگ­آمیزی تری­کروم. بزرگ­نمایی 100×

 

 

تصویر 2. حضور ادم کمتر و رشته های کلاژن فراوان و نسبتا ضخیم و سازمان یافته به رنگ سبز در گروه دو. رنگ آمیزی تری کروم. بزرگ­نمایی 100×

 

 

 

تصویر 3.  نظم درتشکیل بافت استخوانی و پرولیفراسیون کندروسیت­ها در گروه دو به خوبی اعمال شده است. رنگ­آمیزی تری­کروم. بزرگ­نمایی