اثر مزمن نانوذرات نقره کلوئیدی بر تغییرات هیستوپاتولوژیکی بافت آبشش ماهی آزاد دریای خزر (Salmo caspius)

نوع مقاله: بهداشت و بیماری های آبزیان

نویسندگان

1 گروه شیلات، دانشکده علوم دریایی دانشگاه تربیت مدرس، نور، ایران

2 انستیتو پاستور ایران، تهران، ایران

3 مرکز ذخایر زیستی و ژنتیکی ایران، تهران، ایران

چکیده

زمینۀ مطالعه: در حال حاضر نانوذرات نقره، به­ویژه به دلیل خواص ضدمیکروبی، به­طور وسیع در صنایع مختلف و انواع محصولات مصرفی استفاده می­شوند. کاربرد وسیع این نانوذرات احتمال رهایش آن‌ها به بوم­سازگان آبی و تأثیر آن‌ها بر موجودات زنده آبزی را افزایش داده است.
هدف: هدف از پژوهش حاضر بررسی اثرات هیستوپاتولوژیکی نانوذرات نقره کلوئیدی در آب بر آبشش ماهی آزاد دریای خزر بود.
روش‌کار: در این مطالعه 84 ماهی آزاد دریای خزر (40/3±60/26 گرم) در چهار غلظت 0، 01/0، 02/0 و 03/0 میلی‌گرم در لیتر نانوذرات نقره به مدت 14 روز مورد آزمایش قرار گرفتند. در پایان آزمایش، به­منظور تعیین اثرات آسیب بافتی ناشی از نانوذرات نقره، بافت آبشش با تکنیک بافت­شناسی مورد ارزیابی قرار گرفت.
نتایج: آسیب­های بافتی مشاهده­شده شامل هایپرپلازی و هایپرتروفی، کوتاهی تیغه ثانویه آبشش، خمیدگی تیغه آبششی، جداشدگی اپیتلیال تیغه ثانویه آبشش و آنوریسم بود. 
نتیجه‌گیری نهایی: نتایج این پژوهش نشان داد که کلوئید نانوذرات نقره در آب می­تواند به آسیب بافتی در آبشش ماهی آزاد دریای خزر منجر شده و مواجهه طولانی­مدت با غلظت تحت کشنده این نانوذرات می­تواند باعث مرگ این ماهیان شود.

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Chronic Effect of Waterborne Colloidal Silver Nanoparticles on Gill Histopathological Changes of Caspian Brown Trout (Salmo trutta caspius)

نویسندگان [English]

  • Seyyed Morteza Ebrahimzadeh 1
  • Mohammad Reza Kalbassi 1
  • Mahdi Habibi Anbouhi 2
  • Parvaneh Farzaneh 3
1 Department of Aquaculture, Faculty of Marine Sciences, University of Tarbiat Modares, Noor, Iran
2 National Cell Bank of Iran, Pasteur Institute of Iran, Tehran, Iran
3 Iranian Biological and Genetically Resource Center, Tehran, Iran
چکیده [English]

BACKGROUND: Silver nanoparticles are now widely used in various industries and consumer products, especially because of their antimicrobial properties. The widespread use of these nanoparticles has increased the likelihood of their release to aquatic ecosystems and their effects on aquatic organisms.
OBJECTIVES: The purpose of this study was to investigate the histopathological effects of waterborne silver nanoparticles on the gills of Caspian brown trout.
METHODS: In this study, 84 fish (27.46±4.3 g) were tested in four concentrations of silver nanoparticles (0, 0.01, 0.02 and 0.03 mg/L) for 14 days. At the end of the experiment, gill tissue was evaluated to determine the effects of tissue damage caused by silver nanoparticles.
RESULTS: Observed tissue damage included hyperplasia, hypertrophy, curvature of secondary lamellae, shortening of second lamellae, separation of epithelium from lamellae and aneurism.
CONCLUSIONS: The results of this study showed that colloid silver nanoparticles in water could lead to tissue damage in the gills of Caspian brown trout, and long-term exposure to the sublethal concentrations of these nanoparticles can cause fish death.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Silver nanoparticles
  • Chronic effect
  • Histopathology
  • Gill
  • Caspian Sea brown trout

مقدمه

 رشد سریع صنعت نانوفناوری و افزایش تعداد محصولاتی که از ویژگی­های غیرمعمول نانوذرات مهندسی­شده استفاده کرده­اند، بیانگر اهمیت بسیار زیاد این فناوری در اقتصاد جهانی است. افزایش تولید و استفاده از محصولات نانویی به­ناچار به افزایش سطح تخلیه نانومواد به محیط از طریق رهایش تعمدی و تصادفی یا از طریق نشت از محصولات حاوی این مواد انجامیده است. محیط­های آبی احتمالاً به این دلیل­که محلی برای ته­نشینی این مواد هستند، به­طور ویژه حساس و آسیب­پذیرند. شناخت کمی در زمینه سرنوشت نانوذرات در محیط آبی، برهم­کنش­های آن‌ها با اجزای زنده و غیرزنده و توانایی آن‌ها برای ایجاد آسیب وجود دارد و این شناخت ناکافی موجب نگرانی از خطرهای احتمالی این مواد بر بوم­سازگان آبی و آبزیان شده است. در حال حاضر نانوذرات نقره به­ویژه به دلیل خواص ضدمیکروبی، به طور وسیع در صنایع مختلف و حوزه­های گوناگون زندگی روزانه استفاده می­شوند. نانوذرات نقره در حوزه زیست پزشکی (به­عنوان عوامل ضدباکتریایی، پوشش ضدباکتریایی، گندزداها و ضدعفونی کننده­های ابزارآلات پزشکی)؛ در صنعت شیمیایی (رنگ­ها، جلادهنده­ها، چسب­ها، پلیمرها)؛ در محصولات آرایشی و بهداشتی (صابون، خیمر دندان)؛ در بسته­بندی مواد غذایی؛ در لوازم خانگی (یخچال­، ماشین لباس­شویی، تهویه‌کننده‌های هوا با پوشش حاوی نانوذرات)؛ در لباس (جوراب) و وسایل مختلف دیگر استفاده می‌شوند (6،12،18). نانوفناوری این فرصت را در اختیار صنایع شیلاتی قرار داده که از ابزارهای جدید برای تشخیص سریع بیماری، افزایش توانایی ماهیان برای جذب داروهایی مانند هورمون­ها، واکسن­ها و مواد مغذی (25) و تصفیه آب  بهره ببرند (10،13،16،27).

اگرچه خواص ضدمیکروبی نانوذرات نقره به­خوبی شناخته شده است (5)، ولی این نانوذرات در رده­های سلولی مهره­داران اثر سمی داشته­اند و مشخص شده که این سمیت ناشی از تولید گونه‌های فعال اکسیژن (26)، مرگ برنامه­ریزی­شده سلول (آپوپتوز) (23)، افزایش پرواکسیداسیون (3) و کاهش عمکلرد میتوکندری (11) می‌باشد. مطالعات درون­تنی (in vivo) در ماهیان نشان داده که نانوذرات نقره می­توانند اثرات پاتولوژیک بر بافت­های مختلف بدن ماهی داشته باشند که نوع و میزان آسیب به نوع گونه، مراحل مختلف زندگی ماهی، غلظت و مدت زمان مواجهه، شوری و غیره بستگی دارد. تکثیر و تزاید سلولی و التهاب در آبشش، نکروز و التهاب روده و پیگمنتیشن در کبد قزل­آلای رنگین­کمان (14)، هایپرپلازی، ادم (خیز) و جداشدگی اپیتلیوم آبشش و جوش­خوردگی تیغه­های آبششی و هموسیدروز، خونریزی، تورم هیدروپیک و هسته پیکنوتیک در کبد ماهی طلایی (1)، ساختار نامنظم و هسته پیکنوتیک اپیدرم، آپلازی و/ یا جوش­خوردگی تیغه آبششی، تلانژکتازیس، نکروز و جداشدگی اپیتلیال آبشش و اتساع فضای سینوزوئید، رگ­های پُرخون و هسته پیکنوتیک در کبد ماهی خاویاری سیبری (21) از آثار هیستوپاتولوژیکی نانوذرات نقره هستند که در معدود مطالعات انجام شده در این زمینه گزارش شده­اند.

با تـوجـه به افزایـش استفـاده از نانـوذرات نقــره در کاربردهای مصرفی و تجاری و نبود اطلاعات در زمینه اثر نانوذرات بر ماهی آزاد دریای خزر به­عنوان گونه ارزشمند و در معرض خطر، پژوهش حاضر با هدف بررسی اثرات هیستوپاتولوژیکی نانوذرات نقره بر آبشش این ماهی انجام شده است.

مواد و روش‌کار

ویژگی­های نانوذرات نقره: نانوذرات نقره کلوئیدی مورد استفاده در این پژوهش از شرکت نانو نصب پارس با نام تجاری نانوسید (Nanocid® L 2000) ثبت­شده در اداره ثبت اختراعات و نشان ایالات متحده امریکا به شماره 20090013825 خریداری شد (13). براساس اطلاعات شرکت سازنده، نانوذرات نقره کلوئیدی غلظت 4000 میلی‌گرم در لیتر دارد و میانگین اندازه نانوذرات 6/16 نانومتر اعلام شده است. ویژگی­های این محصول کلوئیدی در مطالعة قبلی بررسی (16) و به­طور خلاصه در جدول 1 ارائه شده است.

گونه مورد مطالعه ماهی-ماهی: بچه­ماهیان آزاد دریای خزر (Salmo caspius) برای این آزمایش با میانگین وزنی 40/3±60/26 گرم از مرکز بازسازی ذخایر آزادماهیان شهید باهنر کلاردشت تهیه شدند.

بررسی اثر مزمن نانوذرات نقره بر بافت آبشش: بچه ماهیان به مدت یک هفته با شرایط آزمایشگاهی در مخازن آب شیرین (تانک­های 300 لیتر) سازگار و با غذای تجاری (بیومار) تغذیه شدند (1درصد وزن بدن). سپس، به منظور جلوگیری از جذب نانوذرات به­وسیله مدفوع، 24 ساعت قبل از شروع آزمایش، غذادهی به ماهی­ها قطع شد (14). در طول دورة سازگاری تلفاتی در بین ماهیان مشاهده نشد. بعد از این مدت ماهی­ها به صورت تصادفی به تانک­های آزمایش (100 لیتر) انتقال داده شدند. میزان تراکم ماهی­ها در هر تانک 100 لیتری حدود 7/2 گرم در لیتر بود (در هر تانک 7 ماهی). شاخص­های کیفی آب مانند pH، اکسیژن محلول، دما، سختی کل در طول آزمایش با استفاده از دستگاه دیجیتال (Lovibond water testing) اندازه­گیری شد. میانگین دما (درجه سانتی‌گراد)، pH، سختی (میلی‌گرم در لیتر کربنات کلسیم) و اکسیژن محلول (درصد اشباع) به ترتیب 26/0±62/18، 08/0± 25/8، 34/6±246، 04/2±6/90 بودند. آزمایش تحت شرایط نوری 12 ساعت روشنایی و 12 ساعت تاریکی انجام شد. برای آزمایش از آب شهری کلرزدایی و هوادهی­شده استفاده شد.

غلظت­های 0، 01/0، 02/0 و 03/0 میلی‌گرم در لیتر براساس غلظت کُشنده میانی (LC50؛ داده­های منتشرنشده) انتخاب و برای هر تیمار سه تکرار در نظر گرفته شد. آزمایش به مدت 14 روز  تحت شرایط ساکن با تعویض آب و تجدید غلظت­ها انجام شد و آب مخازن مورد آزمایش هر 24 ساعت یک بار تعویض و غلظت­های نانوذرات مورد مطالعه مجدداً در مخازن اضافه شد. در طول آزمایش برای جلوگیری از جذب نانوذرات به غذا و مدفوع ماهی­ها، غذادهی انجام نشد (14،15). ماهی­های شاهد تحت شرایط یکسان با گروه­های آزمایشی قرار داشتند.

برای آزمایش هیستوپاتولوژی، در پایـان دوره (روز 14) از هـر تیـمـار 6 ماهی به­طور تصادفی برای نمونه­برداری از بافت آبشش انتخاب شدند. ماهی­ها در پودر گل میخک (100 میلی‌گرم در لیتر) بیهوش شدند. به­منظور تثبیت نمونه­ها، بافت­ها که با دقت و بدون آسیب بافتی از بدن خارج شده بودند، بلافاصله به محلول بوئن انتقال داده شدند. برای انجام مطالعه­های بافت­شناسی ابتدا نمـونه­های بافتی از محلول بوئن خارج و به الکل 70 درصد انتقال داده شدند. سپس نمونه­های بافتی در دستگاه خودکار آماده­سازی بافت (Tissue processor, DID SABZ DS 2080/H) آبگیری، شفاف­سازی و پارافینه شدند. در ادامه نمونه­های قالب­گیری­شده با دستگاه میکروتوم (Accu-Cut SRM 200 Rotary Microtome) با ضخامت 5 میکرومتر برش داده شدند. از هر نمونه 3 لام سریالی با کیفیت مناسب تهیه شد و رنگ­آمیزی لام­های حاصله به روش رایج هماتوکسیلین و ائوزین انجام گرفت (14). برش‌های ایجادشده با چسب انتالان روی لام چسبانده شدند، سپس لام­های تهیه­شده با میکروسکوپ نوری (OPTIKA) مجهز به دوربین در بزرگ­نمایی­های مختلف مورد بررسی قرار گرفتند. برای مطالعه آسیب­شناسی بافت آبشش در هر تیمار 500 تیغه ثانویه شمارش شد و تعداد تیغه­های ثانویه­ای که دچار آسیب شده بودند نسبت به تعداد کل تیغه ثانویه سنجیده شدند. شدت تغییرات کمتر از 10 درصد، "بدون تغییر (-)"؛ شدت تغییرات بین 10-30 درصد "تغییر ملایم (+)"؛ شدت تغییرات بین 31-60 درصد "تغییر متوسط (++)" و شدت تغییرات بین 60-100 درصد "تغییر شدید (+++)" در نظر گرفته شدند (14،17،28).

نتایج

در آزمایش 14 روزه برای تعیین سمیت مزمن با افزایش غلظت نانوذرات نقره درصد زنده­مانی ماهیان مورد مطالعه کاهش یافت. تلفات ماهی­ها در غلظت 03/0 میلی‌گرم در لیتر از روز هفتم شروع شد و این تلفات تا روز یازدهم ادامه داشت (تلفات تجمعی 47 درصد). در غلظت 02/0 میلی‌گرم در لیتر تلفات از روز هفتم (تلفات تجمعی 22 درصد) و در غلظت 01/0 میلی‌گرم در لیتر تلفات از روز هشتم (تلفات تجمعی 3 درصد) آغاز شد. در گروه شاهد در طول آزمایش تلفاتی مشـاهده نشد و رفـتار ماهی­ها طبیعی بود. از علائم رفتاری ماهی­های مورد آزمایش در سمیت مزمن که مرگ و میر در آن‌ها مشاهده شد، کف گزینی، افزایش حرکت سرپوش آبششی، برهم خوردن تعادل و بی­اشتهایی (در زمان تغذیه مختصر قبل از تعویض آب) بود.

آبشش ماهیان مورد آزمایش در گروه شاهد از نظر بافت­شناسی طبیعی بود (تصویر a1). در غلظت 01/0 میلی‌گرم در لیتر هایپرپلازی، هایپرتروفی و راس چماقی و کوتاهی تیغه ثانویه ملایم مهم­ترین تغییرات هیستوپاتولوژیکی مشاهده شده بود (تصویر b1). با افزایش غلظت نانوذرات نقره در آب میزان آسیب بافت آبشش افزایش یافت. هایپرپلازی، هایپرتروفی، جداشدگی اپیتلیالی متوسط در غلظت 02/0 میلی‌گرم در لیتر دیده شد که نشان داد با افزایش غلظت بر شدت اثر این نانوذرات افزوده شد. شدیدترین تغییرات هیستوپاتولوژیکی بافت آبشش در غلظت 03/0 میلی‌گرم در لیتر شامل هایپرپلازی، هایپرتروفی، کوتاهی تیغه ثانویه و جداشدگی اپیتلیالی شدید بود (تصویرc,d1؛ جدول 2).

 جدول 1. ویژگی­ های اندازه ­گیری ­شده نانوذرات نقره کلوئیدی مورد استفاده (16).

ویژگی

روش اندازه­گیری

فراسنجه

توضیحات

غلظت (میلی گرم/لیتر)

ICP-AES

3980

با غلظت اعلام­شده از شرکت تولیدی اختلاف ناچیزی دارد.

قطر بیشینه (نانومتر)

TEM

129

14/65 درصد از ذرات قطری بین 13-1 نانومتر دارند. قطر اعلام شده از شرکت تولیدی 6/16 نانومتر است.

شکل

TEM

کروی

-

قطر هیدرودینامیکی (نانومتر)

Zetasizer

9/3 تا 5/163

1/54 درصد از ذرات قطر دینامیکی کمتر از  100 نانومتر دارند.

میانگین قطر هیدرودینامیکی (نانومتر)

Zetasizer

8/54

-

خلوص

EDX

-

در کلوئید نانوذرات نقره تنها عنصر نقره وجود دارد.

 

جدول 2. یافته ­های هیستوپاتولوژیکی آبشش ماهی آزاد دریای خزر بعد از مواجهه مزمن (14 روزه) با غلظت­های تحت کُشنده نانوذرات نقره و گروه شاهد.

ضایعات بافتی*

غلظت (میلی گرم/لیتر)

خمیدگی

هایپرپلازی

هایپرتروفی

راس چماقی

کوتاهی تیغه ثانویه

جداشدگی اپیتلیالی

آنوریسم

0

-

-

-

-

-

-

-

01/0

-

+

+

+

+

-

-

02/0

-

++

++

+

+

++

-

03/0

++

+++

+++

++

+++

+++

+

* بدون تغییر (-)، تغییر ملایم (+)، تغییر متوسط (++) و تغییر شدید (+++).