غربالگری عصاره متانولی برخی از گیاهان بومی استان کردستان از نظر توان مهارکنندگی یا فعال کنندگی آنزیم فیتاز گندم

نوع مقاله: علوم پایه (بیوشیمی، آناتومی، جنین، بافت شناسی و فیزیولوژی)

نویسندگان

گروه علوم زیستی، دانشکده علوم دانشگاه کردستان، سنندج، کردستان، ایران

چکیده

زمینۀ مطالعه: آنزیم فیتاز (EC 3.1.3.8) به عنوان یک افزودنی غذایی در جیره حیوانات تک معدی، با هدف افزایش میزان جذب فسفات موجود در جیره، در شاخه‏های مختلف علوم تغذیه دام، طیور و آبزیان دارای جایگاه ویژه‏ای می‏باشد. با این وجود اقدامات کافی در زمینه تشدید اثر آن یا رفع موانع عمل بهینه آن صورت نگرفته است.
هدف: این پژوهش با هدف یافتن عوامل فعال‏کننده یا مهارکننده فیتاز در منابع گیاهی غنی از متابولیت‏های ثانویه صورت گرفت.
روش‌کار: آنزیم فیتاز از دانه گندم رقم سرداری استخراج گردید. پس از تهیه عصاره متانولی نمونه‏های گیاهی، اثر آن‌ها در چهار غلظت001/0، 01/0، 1/0، و 1 گرم درلیتر، به روش اسپکتروفتومتری میکروپلیت و در طول‌موج 405 نانومتر، بر روی فعالیت فیتاز بررسی شد.
نتایج: در میان عصاره­های متانولی بررسی‌شده، عصاره متانولی چهار گیاه Pedicularis sibthorpii Boiss، Phlomis persica Boiss، Solenanthus Circinatus Ledeb، Stachys lavandulifolia Vahl، اثر مهارکنندگی قابل‌توجهی بر فعالیت آنزیم فیتاز از خود نشان دادند. در مقابل عصاره متانولی شش گیاه Astragalus caraganae Hohe، Hypericum scabrumLinum album Ky.ex Boiss، Valeriana sisymbriifolia Vahl، Euphorbia denticulate Lam، Rindera lanata (Lam.)Bge، اثر فعال‏کنندگی قابل‌توجهی بر فعالیت آنزیم فیتاز از خود نشان دادند.
نتیجه‌گیری نهایی: مطابق نتایج این مطالعه می­توان هم گیاهان دارای خاصیتفعال­کنندگی فیتاز و هم گیاهان دارای خاصیت مهارکنندگی فیتاز را به‌عنوان منابعی بالقوه‏ جهت استفاده در جیره حیوانات تک‏معدی با هدف افزایش راندمان جذب فسفات جیره، پیشنهاد نمود. گروه نخست می‏توان را جهت تقویت فعالیت فیتاز به جیره اضافه کرد و اعضای گروه دوم را، اگر به شکلی در رژیم غذایی این حیوانات موجود باشد می‏توان حذف نمود.

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Screening for Wheat Phytase, Inhibitory or Activating Effect, Among Methanol Extract of Some Kurdistan Province Native Plants

نویسندگان [English]

  • Mohammad Ali Zarei
  • Ramin Mohammadi
Department of Biological Sciences, Faculty of Science, University of Kurdistan, Sanandaj, Kurdistan Province, Iran
چکیده [English]

BACKGROUND: Phytase enzyme (EC 3.1.3.8), is used to increase the availability of phosphorus in the feeding of monogastric animals. Increasing public attention to environmental issues, improving livestock nutrition and human health have led to considerable attempts to increase its activity or prevent its inhibition as a food additive.
OBJECTIVES: Determination of inhibitory or activating effect of methanolic extract from aerial parts of some herbs, as rich sources of secondary metabolites.
METHODS: Phytase was partially purified from wheat barn. After preparation of methanolic extracts from aerial parts of plants, their effects on phytase activity were measured at four concentrations of 0.001, 0.01, 0.1 and 1 mg/ml. Micro plate assays were performed at 405 nm.
RESULTS: Among analysed plant samples, extracts from Pedicularis sibthorpii Boiss, Phlomis persica Boiss, Solenanthus Circinatus Ledeb, Stachys lavandulifolia Vahl, had appreciable inhibitory effect, while extracts from Astragalus caraganae Hohe, Hypericum scabrum L, Linum album Ky.ex Boiss, Valeriana sisymbriifolia Vahl, Euphorbia denticulate Lam, Rindera lanata (Lam.) Bge, had a considerable activation effect.
CONCLUSIONS: According to the results of this report, plants with positive effect on phytase activity, could be used as food additive along with phytase to improve phosphoros uptake. On the other hand, plants with negative effect on phytase could be viewed as unwanted sources in monogastric animals feeding.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Methanolic extract
  • Monogastric animals
  • Phosphorus
  • Phytase
  • Wheat

مقدمه

 

اهمیت مواد معدنی در تغذیه حیوانات از حدود 2000 سال پیش مشخص ‌شده است. در متون علمی وجود 21 عنصر معدنی در جیره ضروری تشخیص داده‌ شده است. مواد معدنی حدود 4 درصد وزن بدن اکثر مهره­داران را تشکیل می­دهند که کلسیم و فسفر بیش از نیمی از این مقدار را در بر می­گیرند. در این میان کلسیم و فسفر به لحاظ مقدار نسبی حضور در جیره، هزینه تأمین و نیز عوارض سوء ناشی از عدم تأمین آن‌ها به مقدار کافی بیشترین توجه را به خود جلب نموده­اند (28). فسفر برای حیوانات یک عنصر ضروری می­باشد که علاوه بر داشتن نقش حیاتی در توسعه و نگهداری بافت اسکلتی، در بسیاری از اعمال متابولیکی نیز اهمیت دارد. فیتک اسید یک فرم آلی فسفر است که برای جانوران تک معده‌ای از قبیل ماکیان، خوک‌ها، ماهیان، انسان و پرندگان قابل‌دسترس نیست؛ چون این جانوران سطح مناسبی از آنزیم­های هیدرولیز کننده فیتات در دستگاه معدی-روده­ای خود ندارند (1،10).

 فیتات (میو-‏‏ اینوزیتول هگزا فسفات) فرم اصلی ذخیره‌ی فسفر در دانه‌های غلات، حبوبات، دانه‌ی گرده و دانه‌های روغنی است (7،20). این مولکول بسیار باردار است و 6 گروه فسفات از حلقه میواینوزیتول مرکزی آن امتداد یافته‏اند. فیتیک­اسید یک فاکتور ضد تغذیه‌ای برای انسان‌ها و دام‌ها به شمار می‌رود؛ زیرا شلاتور نیرومندی برای کاتیون‌هایی از قبیل Ca2+،Mg2+،Fe2+/3+،Zn2+،K+، Mn2+ و Cu2+است و از جذب آن‌ها در دستگاه گوارش جانوران جلوگیری می‌کند. همچنین به علت اتصال به مواد مغذی، آمینواسیدها و چربی‌ها، سبب عدم جذب آن‌ها شده و با اتصال به پروتئین‌ها، سبب جلوگیری از عملکرد صحیح آن‌ها در غذای حیوانات شده و درنتیجه میزان مؤثر این مواد را در رژیم غذایی کاهش می‌دهد (5،8،15،16). به دلیل نبود آنزیم‏های مؤثر جهت هضم فیتات، مقدار زیادی از فسفر به همراه سایر مواد معدنی و غیره از بدن حیوانات تک معده‌ای دفع می‌گردد. فیتات­ تجزیه نشده، نه‌تنها سبب کاهش کیفیت مواد غذایی شده بلکه سبب آلودگی‌های زیست‌محیطی نیز می‌شوند (26).

آنزیم فیتاز (EC 3.1.3.8) یک افزودنی مهم تغذیه‌ای برای افزایش دسترسی به فسفر و دیگر مواد معدنی تغذیه‌ای است که در جیره‏ی حیوانات تک معده‌ای، جهت هیدرولیز اسید فیتیک موجود در جیره مورد استفاده قرار می‏گیرد(6،21،24). در صنایع بیوتکنولوژی از انواع فیتازها در زمینه‌های مختلف ازجمله در حمایت محیط‌زیست، آبزی­پروری و کشاورزی استفاده می‏شود (4،13). از آنزیم‌های فیتاز همچنین به‌عنوان مکمل غذایی جهت افزایش جذب آهن برای مصارف انسانی و همچنین به‌عنوان مکمل در تغذیه ماهی‏ها کاربرد دارد. این آنزیم‌ها، همچنین در صنعت نانوایی، صنایع غذایی و جداسازی پروتئین‌های گیاهی نیز کاربرد دارند (14).

از دید آنزیم‏شناسی فیتازها گروه ویژه‌ای از فسفاتازها یا فسفریک مونواستر هیدرولازها به‌حساب می‌آیند که قادر به هیدرولیز فیتات می‌باشند (23). این آنزیم‌ها از گسترش بالایی در طبیعت برخوردارند و فعالیت فیتازی در گیاهان، جانوران و ریزسازواره­ها گزارش‌شده است که همگی قادر به رهاسازی فسفات از فیتات هستند که منبع اصلی فسفر در دانه گیاهان می‌باشد (12).بدون شک افزایش توجه عمومی به مسائل زیست محیطی، بهبود تغذیه دام و سلامت انسان باعث توجه به توسعه بیوتکنولوژی فیتازها و کاربرد آن‌ها در حیطه‌های مربوطه شده است (17).

گیاهان به علت تنوع زیستی و ساختمان اجزایشان، منابع منحصربه‌فرد و تجدید شدنی برای کشف داروهای جدید هستند. در کشورهای صنعتی حدود 50 درصد از داروهای تجویزشده از گیاهان مشتق شده است و طبق اعلام سازمان بهداشت جهانی، گیاهان برای حدود 4/3 میلیارد نفر به‌عنوان اولین منبع دارویی در کشورهای درحال‌توسعه محسوب می‌شود(3). از نظر تأثیر مواد مختلف بر روی فعالیت آنزیم یون­های مختلف مانند روی، مس، فلوراید و EDTA می­توانند اثر مهارکنندگی و فعال­کنندگی داشته باشند (14،29). تاکنون گزارشی از اثر گیاهان و عصاره آن‌ها بر فعالیت فیتاز گزارش نشده است؛ در این پژوهش برای اولین بار تأثیر عصاره متانولی اندام‌های هوایی گیاهان مختلف بر روی فعالیت آنزیم فیتاز استخراج‌شده از سبوس گندم واریته سرداری که فعالیت فیتازی بالای آن قبلاً توسط نویسنده مورد بررسی قرار گرفته است (30)، مورد سنجش قرارگرفته است. هدف یافتن گیاهانی بود که احتمالاً توان فعال‏سازی یا مهار بالایی بر روی فعالیت فیتاز دارند. تا بتوان از آن‌ها به‏عنوان یک‌راه­حل طبیعی و کم‌هزینه، بدون اثرات جانبی برای جلوگیری از مهار و یا افزایش فعالیت آنزیم فیتازی و به‏عنوان مکمل غذایی به جیره‏ی حیوانات تک معدی استفاده نمود.

مواد و روش‌کار

نمونه‌های گیاهی: اندام‌های هوایی گیاهان، توسط کارشناسی ارشد سیستماتیک گیاهی از مناطق مختلف استان جمع­آوری شدند. پس از شناسایی تاکسونومیک آن‌ها در هرباریوم مرکز تحقیقات کشاورزی و منابع طبیعی استان کردستان، بلافاصله به آزمایشگاه گروه علوم زیستی منتقل ­شدند. گیاهان جمع‌آوری‌شده در سایه و دمای 25 درجه سانتی‏گراد خشک شدند. قبل از تهیه پودر از نمونه­ها، آن‌ها ازلحاظ نظافت و عدم آلودگی به خاک و یا سایر گیاهان بررسی شدند. سپس به‌وسیله قیچی باغبانی به قطعات کوچکی خردشده و به‌وسیله آسیاب مکانیکی به‌صورت پودر نرم در‏آمدند. پودرهای به‌دست‌آمده پس از توزین در ظروف درب­دار پلاستیکی تا زمان عصاره­گیری، در دمای اتاق نگهداری شدند.

تهیه­ی عصاره متانولی: حدود 10 گرم پودر گیاهی در 100 میلی‏لیتر متانول خالص به مدت 24 ساعت (در ظروف تیره و به ‌دور از نور) خیسانده در فواصل زمانی معینی هم‏زده شد. سپس این مخلوط توسط کاغذ صافی واتمن شماره 42 صاف ­شد. مایع صاف‌شده با استفاده از دستگاه روتاری­اواپریتور در دمای 65 درجه سانتی‏گراد تغلیظ شده و پس از تخلیه از مخزن دستگاه، جهت خشک شدن کامل، بر روی شیشه ساعت به قطر 15سانتی‏متر، پخش‌شده و در زیر هود شیمیایی و در دمای محیط قرار ­گرفت. عصاره­های خشک‌شده از روی سطح شیشه ساعت جمع‏آوری و در میکروتیوب تا زمان انجام مراحل بعدی در دمای 20- درجه سانتی‏گراد نگهداری ‏شدند.

تخلیص عصاره آنزیم: برای استخراج آنزیم فیتاز از روش گیبسون و یولا با مختصر تغییراتی استفاده شد (11). حدود 100 گرم از دانه گندم رقم سرداری که از مرکز تحقیقات کشاورزی و منابع طبیعی استان کردستان تهیه شده بود آسیاب گردید. بعد از غربال‏کردن پودر حاصل توسط الک فلزی با قطر منافذ 5/0میلی‏متر؛ 10 گرم از پودر غربال­شده در 100 میلی‏لیتر محلول بافر غذا (با 5/5pH= حاوی: استات سدیم 22/0مولار، کلرید کلسیم 001/0 مولار‏، و محلولِ تویین-20، با غلظت 1/0 گرم در لیتر) حل شد. پس از هم زدن به مدت 60 دقیقه، بشر حاوی مواد فوق به مدت 15 دقیقه بر روی یخ قرار گرفت و بعد از این مدت مایع رویی این بشر از کاغذ صافی عبور داده شد و در بشر دوم جمع­آوری گردید سپس محتویات آن توسط سرنگ از فیلتر PVDF به قطرمنافذ45/0 میکرومتر، عبور داده‌ شده و در بشر سومی جمع­آوری گردید و پس از توزیع در الیکوتهای یک میلی­لیتری، در دمای 20- درجه سانتی‏گراد ، تا مراحل بعدی نگهداری شد. در مراحل بعدی برای رقیق­سازی آنزیم از بافر رقیق­سازی (با 5/5pH= حاوی: اسید استیک 01/0 مولار، استات سدیم 22/0 مولار، کلرید کلسیم  001/0 مولار‏، و محلول تویین-20، با غلظت 1/0 گرم در لیتر) استفاده شد.

سنجش اولیه فعالیت آنزیمی فیتاز و تعیین پارامترهای سنتیکی آنزیم: برای سنجش فعالیت آنزیم فیتاز با استفاده از روش Tran و همکاران در سال 2011 (27) با مختصر تغییراتی استفاده ‌شده است. نحوه سنجش آنزیمی به روش نقطه پایان (End point) بود. زمان‏های صفر و 30 دقیقه بعد از شروع واکنش مبنای سنجش جذب نوری مخلوط واکنش بودند. از غلظت‌های مختلف پارا-نیترو فنیل فسفات (p-NPP) به‌عنوان سوبسترا استفاده شد. سنجش­ در میکروپلیت‏های 96 چاهکی و در حجم کل چاهک 150 میکرولیتر و با استفاده از میکروپلیت­خوانِTecan  مدل Sunrise  به ترتیب زیر انجام شد. ترکیبات زیر به ترتیب وارد چاهک شدند، 120 میکرولیتر  بافر استاتِ سدیم (5/5pH=، حاوی: استات سدیم 200 میلی‏مولار، کلرید کلسیم 1 میلی‏مولار) 10 میکرولیتر از آنزیم فیتاز و 20 میکرولیتر از سوبسترای پارا-نیترو فنیل فسفات (p-NPP) در غلظت‌های مختلف. به‏منظور مخلوط شدن کامل این اجزاء باهم میکروپلیت داخل دستگاه به مدت 5 ثانیه مخلوط شد؛ سپس جذب در طول موج 405 نانومتر قرائت شد. پس از 30 دقیقه گرمخانه‏ای کردن در دمای 45درجه سانتی‏گراد برای توقف واکنش 50 میکرولیتر سود 1/0 ‏مولار به مخلوط فوق اضافه گردید. آنگاه میکروپلیت درون دستگاه میکروپلیت‏خوان قرار گرفت و جذب آن در طول‌موج 405 نانومتر قرائت شد. سنجش­ها با سه بار تکرار انجام شد. چاهک بلانک حاوی اجزاء کامل چاهک تست غیر از آنزیم بود و به‌جای آنزیم 10 میکرولیتر به حجم بافر استات سدیم در این چاهک اضافه شد. بر این اساس شیب نواحی خطی نمودارهای تغییرات جذب در مقابل زمان در غلظت‌های مختلف سوبسترا، (که در واقع سرعت اولیه (Vo) برای آن غلظت از سوبسترا محسوب می‏شود) بدست آمد و در رسم نمودار ثانویه تغییرات سرعت اولیه واکنش در مقابل غلظت سوبسترا و سایر محاسبات بعدی ملاک مقایسه قرار گرفت.

سنجش اثر عصاره­ها بر روی فعالیت آنزیم فیتاز: در این مطالعه جهت سنجش اثر عصاره­های گیاهی بر روی فعالیت آنزیم فیتاز نیز از روش اصلاح‌شده‌ی Tran و همکاران در سال 2011 استفاده گردید (27). همه عصاره­ها چهار غلظت001/0، 01/0، 1/0، و 1 گرم در لیتر آزمایش شد­­ند. سنجش­ها در میکروپلیت­های 96 چاهکی و در حجم کل150 میکرولیتر و با استفاده از دستگاه میکروپلیت­خوان به ترتیب زیر انجام شد. به هر چاهک  100 میکرولیتر بافر استات سدیم، 10میکرولیتر محلول فیتاز و 20 میکرولیتر از عصاره (محلول در آب مقطر) اضافه شد. جهت تأثیر ترکیبات موجود در عصاره بر آنزیم، به مدت 5 دقیقه گرمخانه‏ای شدن انجام شد. برای شروع واکنش، 20 میکرولیتر از سوبسترای پارا-نیترو فنیل فسفات (p-NPP) 6 میلی‏مولار، به مخلوط واکنش اضافه گردید. پس از 30 دقیقه گرمخانه‏ای کردن در دمای  45 درجه سانتی‏گراد برای توقف واکنش 50 میکرولیتر محلول  سود 1/0 مولار به مخلوط فوق اضافه شد. آنگاه میکروپلیت درون دستگاه میکروپلیت‏خوان قرارگرفته، جذب آن در طول‌موج 405 نانومتر، قرائت گردید. تمام سنجش­ها با سه بار تکرار انجام شدند. هم­چنین برای سنجش­های هر میکروپلیت، از کنترل منفی استفاده گردید. در چاهک کنترل منفی بجای عصاره از بافر فسفات استفاده شد. پس از پایان سنجش، جذب پلیت خالی از جذب چاهک­های متناظر، کسر شد و سپس با تفریق جذب چاهک بلانک از جذب چاهک تست، جذب نهایی محاسبه گردید. سرعت واکنش بر اساس شیب نمودار جذب علیه زمان محاسبه شد. با استفاده از رابطۀ زیر درصد مهار فیتاز به­وسیله عصاره بدست آمد. در این معادله عدد منفی بدست آمده نشان­دهنده فعال‌کنندگی و عدد مثبت نشان‌دهنده‌ مهارکنندگی عصاره متانولی می‌باشد. تحلیل داده‏ها با استفاده از نرم­افزار اکسل انجام‌ شد.

100×{(شیب کنترل منفی)/(شیب عصاره-شیب کنترلمنفی)}=درصدمهار

 

جدول 1. تأثیرات فعال‌کنندگی یا مهارکنندگی فیتاز، توسط عصاره متانولی گیاهان مختلف.

ردیف

نام علمی گیاه

خانواده

درصد فعال­کنندگی و مهارکنندگی

غلظت‏های عصاره متانولی هرگیاه (گرم/لیتر)

001/0

01/0

1/0

1

1

Alcea kurdica (Flowers)

Malvaceae

32/17

23/27

19/3

00/0

2

Alcea kurdica (Leaves)

Malvaceae

85/1

94/7

17/6

06/17

3

Allium stipitatum Boiss.

Alliaceae

96/2

00/0

86/5

17/29

4

Asperugo procumbens L.

Boraginaceae

15/16-

00/15-

04/8-

93/3-

5

Astragalus caraganae Hohen.

Papilionaceae

78/33-

17/55-

81/45-

22/0

6

Astragalus caryolobus Bge

Papilionaceae

09/8

66/9

30/0

14/11

7

Astragalus cyclophyllon G.Beck

Papilionaceae

07/9

52/9

62/1

44/18

8

Astragalus glumaceus (Leaves)

Fabaceae

03/3-

16/3

85/48

68/24

9

Astragalus siliquosus Boiss.subsp.siliquosus

Papilionaceae

50/5

06/3

95/3

34/19

10

Campanula involucrata Auch.ex DC.

Campanulaceae

27/15

00/0

60/15

41/45

11

Centaurea Behen L.

Asteraceae

76/22-

88/25-

87/19-

38/5

12

Chaerophyllum macropodum Boiss.

Apiaceae

29/29-

67/11-

59/13-

05/8

13

Conium maculatum L.

Apiaceae

25/31-

86/26-

26/81-

25/25-

14

Crambe orientalis L.

Brassicaceae

19/20-

97/15-

83/11-

78/8-

15

Cruciata taurica (Pall.ex Willd) Ehrend

Rubiaceae

6/85-

91/7-

89/7

35/46

16

Descurainia sophia (L.) Webb & Berth.

Brassicaceae

81/16-

69/9-

66/8-

47/27

17

Eremostachys macrophylla Montbr. & Auch

Lamiaceae

30/3-

95/0

11/2-

58/12

18

Euphorbia denticulate Lam.

Euphorbiaceae

94/41-

26/22-

39/38-

67/58-

19

Ferula haussknechtii Wolff ex Rech.

Apiaceae

70/1-

43/18-

72/16-

83/35

20

Fumaria vaillantii Loisel.

Fumariaceae

27/19

35/2

70/11

54/32

21

Heptaptera anatolica (Boiss.) Tutin

Apiaceae

40/11

38/7

55/2

44/47

 

22

Hypericum scabrum L.

Guttiferae

85/58-

87/40-

76/42-

52/23

 

23

Leontice leontopetalum L.

Podophyllaceae

70/5

50/11

02/4

92/28

 

24

Linum album Ky.ex Boiss.

Linaceae

51/51-

71/51-

35/51-

29/37-

 

25

Linum glaucum Boiss.& Noe

Linaceae

98/34

85/1

42/3

10/13

 

26

Marrubium cuneatum Russell

Lamiaceae

90/4

47/4

16/12

28/22

 

27

Nonea hypoleia Bornm.

Boraginaceae

46/2

68/6-

00/14-

75/23

 

28

Pedicularis sibthorpii Boiss

Scrophulariaceae

00/0

91/2

19/13

35/56

 

29

Peganum harmala L.var. harmala

Zygophyllaceae

17/24

44/2

00/0

12/11

 

30

Phlomis persica Boiss.

Lamiaceae

89/1

49/8

75/12

10/57

 

31

Rindera lanata (Lam.) Bge.

Boraginaceae

83/44-

91/66-

18/29-

98/20-

 

32

Saccharum ravennae

Poaceae

60/21-

33/16-

22/8-

34/45

 

33

Scorzonera calyculata Boiss.

Asteraceae

16/11-

75/19-

50/2

28/32

 

34

Silene commelinifolia Boiss.

Caryophyllaceae

30/44-

21/27-

11/38-

14/47

 

35

Silene latifolia Poir.

Caryophyllaceae

14/13-

77/8-

78/6-

13/9-

 

36

Solenanthus circinatus Ledeb.

Boraginaceae

78/3

47/4-

18/2

99/68

 

37

Stroganowia persica Busch

Brassicaceae

93/24-

63/17

50/22-

96/14

 

38

Stachys lavandulifolia Vahl

Lamiaceae

55/34

36/10

05/16

20/69

 

39

Valeriana sisymbriifolia Vahl

Valerianaceae

89/45-

07/52-

84/42-

05/26-

 

40

Veronica orientalis Miller

Scrophulariaceae

28/9-

96/18-

93/30-

71/5

 

41

Vicia hyrcanica Fisch. & C. A. Mey.

Papilionaceae

99/2-

28/17-

34/19-

96/5

 

                           

 

 

نتایج


نتایج سنجش اولیه فعالیت آنزیمی فیتاز و تعیین پارامترهای سنتیکی فیتاز: نمودار تغییرات سرعت اولیه واکنش فیتاز در مقابل تغییرات غلظت‌های مختلف سوبسترا تا غلظت  6 میلی‏مولار، دارای شکل سهمی راست‌گوشه بود که نشان‌دهنده پیروی رفتار فیتاز از مدل میکائیلیس– منتن است (تصویر 1). در غلظت‌های بالاتر از این مقدار سرعت اولیه واکنش شروع به کاهش می­نمود که نشانگر نوعی مهار توسط سوبسترا می‏باشد. با استفاده از رویکردهای خطی مانند رویکرد لاینویوور– برک، مقدار Km برابر با 1/0 میلی‏مولار، و مقدار Vmaxبرابر با  9/0 میلی‏مولار در دقیقه تعیین شدند (تصویر 2). بر اساس نتایج این بخش از مطالعات غلظت  6 میلی‏مولار از سوبسترا برای سنجش اثرات فعال­کنندگی یا مهارکنندگی عصاره­های گیاهی برای فعالیت آنزیم فیتاز انتخاب شد.

 

تصویر 1. تغییرات سرعت واکنش فیتاز در مقابل سوبسترای پارانیترو فنیل فسفات.

تصویر 2. نمودار معکوس مضاعف (لاینویور-برک) برای واکنش فیتاز در مقابل سوبسترای پارانیترو فنیل فسفات.

 

نتایج سنجش اثر عصاره­ها بر روی فعالیت آنزیم فیتاز: در میان گیاهانی که بدین روش بررسی شدند، آن‌هایی که اثرِ مهارکنندگی و فعال­کنندگی بالاتر از 50 درصد داشته­اند، به عنوان گیاهان دارای اثرِ مهارکنندگی و فعال­کنندگی قوی طبقه­بندی شدند. در این میان چهار گیاه Pedicularis sibthorpiiBoiss (در غلظت1 میلی‏گرم‏درمیلی‏لیتر؛ 35/56­ درصد)، PhlomispersicaBoiss (در غلظتِ1 میلی‏گرم‏درمیلی‏لیتر؛ 10/57 درصد)، SolenanthuscircinatusLedeb (در غلظتِ1 میلی‏گرم‏درمیلی‏لیتر؛ 99/68 درصد)، Stachys lavandulifoliaVahl (در غلظت1 میلی‏گرم‏ در میلی‏لیتر؛ 20/69 درصد)، اثر مهارکنندگی بالای 50 درصد، از خود نشان دادند (جدول 1).

همچنین شش گیاه  Astragalus caraganae Hohe(در غلظت 01/0 میلی‏گرم‏درمیلی‏لیتر؛ 17/55- درصد)، Hypericum scabrum L (در غلظت 001/0 میلی‏گرم‏درمیلی‏لیتر؛ 85/58- درصد)، Linum album Ky.ex Boiss (در غلظت‏های 1/0، 01/0 و 001/0 میلی‏گرم‏درمیلی‏لیتر، به ترتیب 35/51- درصد 71/51- درصد و 51/51- درصد)، Valeriana sisymbriifolia Vahl (در غلظت 01/0 میلی‏گرم‏درمیلی‏لیتر؛ 07/52- درصد)، Euphorbia denticulate Lam (در غلظت 1 میلی‏گرم‏درمیلی‏لیتر؛ 67/58- درصد)، Rindera lanata (Lam.)Bge (در غلظت 01/0 میلی‏گرم‏درمیلی‏لیتر؛ 91/66- درصد) ، اثر فعال­کنندگی بالای 50 درصد از خود نشان دادند (جدول 1). نتایج مربوط به سایر گیاهان و سایر غلظت‌های کارشده به‌طور کامل در جدول (1) آمده است.

بحث

آنزیم‌ فیتاز اغلب در بذر و دانه گرده گیاهان عالی از قبیل غلات، دانه‌های روغنی و مغزدارها یافت شده و به میزان کمتر در ریشه گیاهان وجود دارد (12). فعالیت فیتازی در موقع جوانه زدن بذر و دانه گرده به کار می‌آید. در بذر گیاهان به هنگام جوانه زدن فعالیت فیتازی افزایش سریعی نشان می‌دهد (9). بیشترین فعالیت فیتازی در غلاتی چون چاودار، جو و گندم از 100 تا 7000 واحد فعالیت در کیلوگرم، گزارش شده است (26).

جانوران تک معدی از قبیل خوک، طیور و ماهی به دلیل فقدان فیتاز در سیستم گوارشی خود قادر به استفاده از فیتات موجود در جیره غذایی خود نمی‌باشند؛ بنابراین برای تأمین فسفات معدنی موردنیاز، آنزیم فیتاز به جیره آن‌ها افزوده می‌شود. از طرفی افزودن فسفر به جیره، به‌صورت معدنی و قابل‌جذب دارای اثرات زیان‌بارتری بوده و گزینه مناسبی نیست (2،19). همچنین هزینه زیاد تخلیص فیتاز و افزودن آن به جیره غذایی خود یکی دیگر از مشکلات است (22). نکته قابل‌توجه آن است که زمان کم حضور فیتات در سیستم گوارشی پرندگان و محدودیت pH حاکم بر سیستم گوارشی آن‌ها، اجازه تجزیه کامل را به آن نخواهد داد و فیتازهای افزودنی تنها قادر به تجزیه 35 درصد فیتات جیره خواهند بود (25).

از روش­های مختلفی برای سنجش فعالیت فیتاز استفاده شده است و مقادیر Km گزارش شده برای آن‌ها از 10 تا 650 میکرو‏مولار متغییر است. فیتازهای گیاهی نیز از نظر سنتیک تفاوت قابل‌توجهی نشان می‏دهند. در این پژوهش از روش میکرو برای سنجش و تعیین پارامترهای سنتیکی استفاده شده است و مقدار Km تعیین‌شده (100 میکرو‏مولار) در محدوده مقادیر گزارش شده برای فیتازهای گیاهی است که Km آن‌ها از 30 تا 300 میکرو‏مولار متغیر می‌باشد (18).

هزینه زیاد تخلیص و تجاری­سازی آنزیم­ها و از دست دادن فعالیت مناسب ویژه می­تواند یکی از مشکلات افزودن آنزیم فیتاز به غذای جانوران باشد. از طرف دیگر استفاده از فیتاز با منشأ گیاهی در جیره غذایی جانوران تک معده‌ای از قبیل خوک، طیور، ماهی و همچنین شناسایی عوامل دارای اثر فعال­کنندگی یا مهارکنندگی فعالیت آنزیم فیتاز که افزودن (برای فعال‏کننده) یا حذف (برای مهارکننده) منابع گیاهی آن‌ها از جیره غذایی می­تواند باعث افزایش فعالیت فیتازی، جذب فسفر و کم کردن اثرات زیان‌بار آن و کاهش هزینه مربوط به افزودن آنزیم به جیره غذایی جانوران شود. در همین راستا و برای اولین بار با توجه به نتایج این پژوهش (جدول 1) در میان گیاهان غربالگری شده چهار گیاه دارای خاصیت مهارکنندگی و شش گیاه دارای خاصیت فعال­کنندگی بالایی 50 درصد بر روی فعالیت فیتاز بودند. افزودن گیاهان دارای اثر فعال‏کنندگی یا عصاره آن‌ها به جیره غذایی می­تواند یک‌راه­ تشدید فعالیت فیتاز موجود در منابع گیاهی جیره غذایی بوده و یک ‌راه‌حل با منشاء طبیعی باشد. همچنین می­توان با حذف گیاهانی دارای خاصیت مهارکنندگی از جیره غذایی باعث افزایش فعالیت فیتاز طبیعی موجود در گیاهان و دانه­های آن‌ها شد. موارد فوق طبعاً نیاز به تحقیقات بیشتر و پژوهش­های در همین راستا دارد. لازم به ذکر است که غربالگری عصاره متانولی گیاهان و اثر مهاری یا فعال­کنندگی گونه­های گیاهی ذکرشده در این مطالعه بر روی آنزیم فیتاز برای اولین بار بررسی‌شده و مطالعه مشابهی تاکنون صورت نگرفته است.

نتیجه­گیری نهایی: نتایج این پژوهش نشان داد که چهار گیاه Pedicularis sibthorpii Boiss، Phlomis persicaBoiss، Solenanthus Circinatus Ledeb، Stachys lavandulifoliaVahl، فعالیت مهارکنندگی؛ و شش گیاه Astragalus caraganaeHohe، Hypericum scabrumLinum albumKy.ex Boiss، Valeriana sisymbriifolia Vahl، Euphorbia denticulate Lam، Rindera lanata(Lam.)Bge، فعالیت فعال­کنندگی بالایی 50 درصد را بر روی آنزیم فیتاز داشته­اند. لذا جداسازی و خالص­سازی عوامل بالقوه‏ مؤثر در این گیاهان و تأثیر آن‌ها بر روی فیتاز می­تواند موضوع مناسبی برای پژوهش­هایی آینده باشد.

سپاسگزاری

نویسندگان، بدین­وسیله از آقای مهندس حسین معروفی عضو هیئت‌علمی مرکز تحقیقات کشاورزی و منابع طبیعی استان کردستان به دلیل کمک­های کارشناسی در جمع‌آوری و شناسایی علمی نمونه­های گیاهی، صمیمانه تشکر و قدردانی می‌نمایند.

تعارض منافع

بین نویسندگان تعارض در منافع گزارش نشده است.

  1. Balwani, I., Chakravarty, K., Gaur, S. (2017). Role of phytase producing microorganisms towards agricultural sustainability. Biocatal Agric Biotechnol, 12, 23-29. https://doi.org/10.1016 /j.bcab.2017.08.010 
  2. Bekalu, Z. E., Madsen, C. K., Dionisio, G., Brinch-Pedersen, H. (2017). Aspergillus ficuum phytase activity is inhibited by cereal grain components. PloS one, 12(5), e0176838. https:// doi.org/10.1371/journal.pone.0176838  PMID: 28472144
  3. Benamar, H., Rached, W., Derdour, A., Marouf, A. (2010). Screening of Algerian medicinal plants for acetylcholinesterase inhibitory activity. J Biol Sci, 10, 1-9. https://scialert.net/abstract/?doi=jbs.2010.1.9
  4. Chen, R., Xue, G., Chen, P., Yao, B., Yang, W., Ma, Shi, J. (2008). Transgenic maize plants expressing a fungal phytase gene. Transgenic Res, 17, 633-643. https://doi.org/10.1007/s1 1248-007-9138-3PMID: 17932782
  5. Cowieson, A. J., Ruckebusch, J. P., Sorbara, J. O. B., Wilson, J. W., Guggenbuhl, P., Tanadini, L., Roos, F. F. (2017). A systematic view on the effect of microbial phytase on ileal amino acid digestibility in pigs. Anim Feed Sci Technol, 231, 138-149.http://dx.doi.org/doi:10.1016/j.anifeedsci.2017.07.007
  6. Dersjant-Li, Y., Plumstead, P., Awati, A., Remus, J. (2018). Productive performance of commercial growing and finishing pigs supplemented with a Buttiauxella phytase as a total replacement of inorganic phosphate. Animal Nutrition, 4, 351-357. https://doi.org/10.1016/j.aninu.2018.02.002
  7. Dersjant-Li, Y., Wealleans, A. L., Barnard, L. P., Lane, S. (2017). Effect of increasing Buttiauxella phytase dose on nutrient digestibility and performance in weaned piglets fed corn or wheat based diets. Anim Feed Sci Technol, 234, 101-109. http://dx.doi.org/10.1016/j.anifeedsci.2017.09.008
  8. De Angelis, M., Gallo, G., Corbo, M. R., Mc Sweeney, P. L., Faccia, M., Giovine, M., Gobbetti, M. (2003). Phytase activity in sourdough lactic acid bacteria: purification and characterization of a phytase from Lactobacillus sanfranciscensis CB1. Int J Food Microbial, 87, 259-270. https://doi.org/10.1016/S0168-1605(03)00072-2
  9. Dvorakova, J. (1998). Phytase: sources, preparation and exploitation. Folia Microbial, 43, 323-338. https://doi.org/ 10.1007/bf02818571 PMID: 9821286
  10. Esakkiraj, P., Sandoval, G., Sankaralingam, S., Immanuel, G., Palavesam, A. (2010). Preliminary optimization of solid-state phytase production by moderately halophilic Pseudomonas AP-MSU 2 isolated from fish intestine. Ann Microbial, 60, 461-468. https://doi.org/ 10.1007/s13213-010-0064-x
  11. Gibson, D. M., Ullah, A. H. (1988). Purification and characterization of phytase from cotyledons of germinating soybean seeds. Arch Biochem Biophys, 260, 503-513. https://doi.org/10.1016/0003-9861(88)90475-4
  12. Jain, J., Singh, B. (2016). Characteristics and biotechnological applications of bacterial phytases. Process Biochem, 51, 159-169.  https://doi.org/10.1016/j.procbio.2015.12.004
  13. Jorquera, M., Martinez, O. S. C. A. R., Maruyama, F., Marschner, P., de la Luz Mora, M. (2008). Current and future biotechnological applications of bacterial phytases and phytase-producing bacteria. Microbes Environ, 23, 182-191. https://doi.org/10.1264/jsme2.23.182
  14. Konietzny, U., Greiner, R. (2002). Molecular and catalytic properties of phytate‐degrading enzymes (phytases). Int J Food Sci Tech, 37, 791-812. https://doi.org/10.1046/j.1365-2621.2002.00617.x
  15. Kumar, V., Sinha, A. K., Makkar, H. P., Becker, K. (2010). Dietary roles of phytate and phytase in human nutrition: A review. Food Chem, 120, 945-959. https://doi.org/10.101 6/j.foodchem.2009.11.052
  16. Lee, L. Y., Mitchell, A. E. (2018). Determination of D‐myo‐inositol phosphates in “activated” raw almonds using anion exchange chromatography coupled with tandem mass spectrometry LC‐MS/MS. J Sci Food Agric, 99, 117-123.  https://doi.org/10.1002/jsfa.9151 PMID: 29808577
  17. Lei, X. G., Ku, P. K., Miller, E. R., Yokoyama, M. T., Ullrey, D. E. (1993). Supplementing corn-soybean meal diets with microbial phytase maximizes phytate phosphorus utilization by weanling pigs. J Anim Sci, 71, 3368-3375.  https://doi .org/10.2527/1993.71123368x PMID: 8294289
  18. Lei, X. G., Porres, J. M., Mullaney, E. J., Brinch-Pedersen, H. (2007). Phytase: source, structure and application. Polaina, J., MacCabe, A. P. (eds.). (1st ed.)  Springer. Dordrecht, Netherlands. p. 505-530.
  19. Lei, X. G., Porres, J. M. (2003). Phytase enzymology, applications, and biotechnology. Biotechnol let, 25, 1787-1794. PMID: 14677699.
  20. Lott, J. N., Ockenden, I., Raboy, V., Batten, G. D. (2000). Phytic acid and phosphorus in crop seeds and fruits: a global estimate. Seed Sci Res, 10, 11-33. https://doi.org/10.1017/S0 960258500000039
  21. Muslim, S. N., Ali, A. N. M., AL-Kadmy, I. M., Khazaal, S. S., Ibrahim, S. A., Al-Saryi, N. A, Aziz, S. N. (2017). Screening, nutritional optimization and purification for phytase produced by Enterobacter aerogenes and its role in enhancement of hydrocarbons degradation and biofilm inhibition. Microb Pathog, 115, 159-167. https://doi.org/1 0.1016/j.micpath.2017.12.047  PMID: 29269246
  22. Nelson, T. S., Shieh, T. R., Wodzinski, R. J., Ware, J. H. (1968). The availability of phytate phosphorus in soybean meal before and after treatment with a mold phytase. Poultry Sci, 47, 1842-1848. https://doi.org/10.3382/ps.0471842
  23. Nuobariene, L., Cizeikiene, D., Gradzeviciute, E., Hansen, A. S., Rasmussen, S. K., Juodeikiene, G., Vogensen, F. K. (2015). Phytase-active lactic acid bacteria from sourdoughs: Isolation and identification. LWT-Food Sci Technol, 63(1), 766-772. http://dx.doi.org/10.1016/j.lwt.2015.03.018PMID: 26397032
  24. Reddy, N. R., Sathe, S. K., Salunkhe, D. K. (1982). Phytates in legumes and cereals. Adv Food Res, 28, 1-92. https:// doi.org/10.1016/S0065-2628(08)60110-X   PMID: 6299067
  25. Selle, P. H., Ravindran, V. (2007). Microbial phytase in poultry nutrition. Anim Feed Sci Tech, 135, 1-41. https://doi.org/10.1016/j.anifeedsci.2006.06.010
  26. Singh, B. (2017). Purification and characterization of a protease-resistant phytase of Aspergillus oryzae SBS50 whose properties make it exceptionally useful as a feed supplement. Int J Biol Macromol, 103, 458-466. http://dx.doi.org/ doi:10.1016/j.ijbiomac.2017.05.077   PMID: 28527994
  27. Tran, T. T., Hatti-Kaul, R., Dalsgaard, S., Yu, S. (2011). A simple and fast kinetic assay for phytases using phytic acid–protein complex as substrate. Anal Biochem, 410, 177-184. https://doi.org/10.1016/j.ab.2010.10.034  PMID: 21050837
  28. Waldroup, P. W., Ammerman, C. B., Harms, R. H. (1965). The utilization of phosphorus from animal protein sources for chicks. Poultry Sci, 44, 1302-1306.  https://doi.org /10.3382/ps.0441302
  29. Wyss, M., Brugger, R., Kronenberger, A., Rémy, R., Fimbel, R., Oesterhelt, G., van Loon, A. P. (1999). Biochemical characterization of fungal phytases (myo-inositol hexakisphosphate phosphohydrolases): catalytic properties. Appl Environ Microb, 65, 367-373. PMID: 9925555
  30. Zarei, M.A. (2007). Phytase Activity in the Grain of 6 Varieties of Wheat Cultivated in Kurdistan Province. Int J Poult Sci, 6, 634-636. https://doi.org /10.3923/ijps.200  7.634.636