بررسی مولکولی و هماتولوژیک آلودگی به آناپلاسما مارژیناله در گاومیش‌های رودخانه‌ای کشتارشده در اهواز

نوع مقاله: بهداشت و بیماری های دام های بزرگ

نویسندگان

1 گروه علوم درمانگاهی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه شهید چمران اهواز، اهواز، ایران

2 دانش آموخته دانشکده دامپزشکی، دانشگاه شهید چمران اهواز، اهواز، ایران

3 گروه پاتوبیولوژی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه شهید چمران اهواز، اهواز، ایران

چکیده

زمینۀ مطالعه: اطلاعات اندکی در زمینه عفونت به آناپلاسما مارژیناله در گاومیش رودخانه‌ای موجود است و تا کنون گزارشی از آناپلاسموز بالینی گاومیش در ایران یافت نشده است.
هدف: بررسی مولکولی و هماتولوژیک آلودگی به آناپلاسما مارژیناله در گاومیش‌های به ظاهر سالم ارجاعی به کشتارگاه اهواز.
روش‌کار: از 103 رأس گاومیش به ظاهر سالم ارجاعی به کشتارگاه نمونه‌های خون و بافت طحال اخذ گردید. نمونه‌های خون با روش‌های گسترش میکروسکوپی و PCR و نمونه‌های طحال فقط با آزمایش PCR بررسی شدند. در این مطالعه یک روش nested-PCR با تکثیر قطعه‌ای از ژن groEL باکتری مورد استفاده قرار گرفت.
نتایج: میزان آلودگی نمونه‌های خون و طحال به روش PCR به ترتیب 1/31 و 9/1درصد بود. گاومیش‌هایی که در آزمایش PCR طحال مثبت بودند، در PCR خون نیز مثبت شدند. اجرام آناپلاسمایی در گسترش خونی 5/15درصد نمونه‌ها مشاهده شد. ضریب توافق کاپای ضعیفی بین نتایج گسترش میکروسکوپی و PCR خون یافت شد. تفاوت معنی‌داری از نظر میانگین شاخص‌های هماتولوژیک بین دام‌های آلوده و غیر آلوده در روش PCR یافت نشد.
نتیجه‌گیری نهایی: میزان قابل توجه آلودگی به آناپلاسما مارژیناله در گاومیش‌های تحت مطالعه، می‌تواند نقش احتمالی گاومیش به عنوان مخزن عامل بیماری و انتقال آن را به گاو مطرح ‌کند.

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Molecullar and Hematologic Survey on Anaplasma marginale Infection in Slaughtered Water Buffaloes (Buballous buballis) in Ahvaz City, Iran

نویسندگان [English]

  • Ali Abbas Nikvand 1
  • Ehsan Hasanpour Besati 2
  • Darioush Gharibi 3
  • Seyedeh Missagh Jalali 1
1 Department of Clinical Sciences, Faculty of Veterinary Medicine, Shahid Chamran University of Ahvaz, Ahvaz, Iran
2 Graduated from the Faculty of Veterinary Medicine, Shahid Chamran University of Ahvaz, Ahvaz, Iran
3 Department of Pathobiology, Faculty of Veterinary Medicine, Shahid Chamran University of Ahvaz, Ahvaz, Iran
چکیده [English]

BACKGROUND: There is paucity of information about Anaplasma marginale (A. marginale) infection in water buffaloes and there have not been any reports of clinical anaplasmosis in the buffaloes in Iran.
OBJECTIVES: Molecullar and hematologic survey on A. marginale infection in apparently healthy buffaloes referring to Ahvaz abattoir.
METHODS: Samples of blood and spleen tissue were obtained from 103 healthy buffaloes referring to the slaughterhouse. Blood samples were subjected to microscopic examination and PCR assay while spleen specimens were only analyzed by PCR. In this study, a nested-PCR method was used to amplify a fragment of the groEL gene of the bacterium.
RESULTS: According to PCR, 31.1% and 1.9% of examined blood and spleen samples were found positive for A. marginale, respectively. The buffaloes which were positive in spleen tissue PCR test were positive in blood PCR, as well. Microscopically, Anaplasma-like organisms were found in 15.5% of stained blood smears. There was a slight Kappa agreement between stained blood smears and PCR. No significant difference was found in hematologic values between the infected and non-infected buffaloes based on PCR results.
CONCLUSIONS: Significant occurrence of infection with A. marginale in the studied buffaloes can indicate the probable role of buffalo as a reservoir of the disease agent and its transmission to the cattle.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Anaplasma marginale
  • groEL
  • PCR
  • spleen
  • Water buffalo

مقدمه


آناپلاسما یک باکتری داخل سلولی اجباری هست که اریتروسیت‌های مهره­داران عالی به­ویژه نشخوارکنندگان را آلوده می­کند (4،12). از جنس آناپلاسما، آناپلاسما مارژیناله در گاو و نشخوارکنندگان وحشی و آناپلاسما اویس در گوسفند و بز عامل بیماری است.  آناپلاسما سنتراله نیز که ارتباط نزدیکی با آناپلاسما مارژیناله دارد، عامل آناپلاسموز خفیف در گاو در آفریقا شناخته شده است (1،4). نه تنها گاو، بلکه دیگر نشخوارکنندگان اهلی و وحشی مانند گاومیش رودخانه­ای دچار عفونت دائمی و ناقل برای آناپلاسما مارژیناله می­شوند (16). آناپلاسموزیس می­تواند با زیان اقتصادی چشمگیری همراه باشد، طوری که تخمین زده می­شود که خسارات سالیانه اقتصادی ناشی از آناپلاسما مارژیناله در ایالات متحده به حدود 300 میلیون دلار می­رسد (18). مطالعات سرولوژیک نشان داده­اند که گاومیش آمریکایی مخزن آناپلاسما مارژیناله می­باشد و حیوانات مخزن می­توانند منبعی ماندگار از خون آلوده جهت انتشار مکانیکی از طرق مختلف و نیز انتقال بیولوژیک توسط کنه­ها باشند (5).  مشخصه بارز آناپلاسموز بالینی، آنمی ناشی از فاگوسیتوز اریتروسیت­های آلوده است. شدت علائم بالینی با درجه آنمی مرتبط است و شامل بی­رنگی پوست و غشاهای مخاطی و افزایش ضربان قلب و تنفس می­باشد (4،12).

تشخیص آناپلاسموز گاوی ممکن است به­طور تجربی و بر اساس منطقه جغرافیایی، فصل و علائم بالینی و یا یافته­های کالبدگشایی در حیوانات مبتلا صورت گیرد. جهت تأیید تشخیص آزمون­های آزمایشگاهی مانند بررسی گسترش خون، روش­های تشخیصی سرولوژیک یا مولکولی مورد نیاز است. از روش PCR  با استفاده از پرایمرهایی از ژن اپران groEL برای تشخیص گونه­های آناپلاسما استفاده شده است (22). ژن groEL، که کد کننده پروتئین­های خانواده chaperonin است، در باکتری­های متعددی یافت می­شود (27). مزیت آن این است که تغییرات بیشتری بین گونه­ها نسبت به ژن 16S rRNA دارد (8،25)، در حالی که ژن 16S rRNA دارای هم­خوانی بسیار نزدیک بین گونه­های نزدیک است (26).

گاومیش در ایران در سه اقلیم متفاوت، مرتفع سردسیر، معتدل و مرطوب مدیترانه­ای و پست جلگه­ای گرم (شامل استان خوزستان و قسمتی از لرستان) نگهداری می­شود (7). بنابر گزارش مرکز آمار ایران در سال 1390، جمعیت کل گاومیش­های ایران، حدود 160 هزار رأس بوده و تقریباً 100 هزار رأس آن در استان خوزستان پرورش داده می­شوند. تولید شیر در گاومیش­های مناطق مختلف ایران با همدیگر متفاوت است به­طوریکه تعداد روزهای شیردهی و مقدار شیر (کیلوگرم در سال) در گاومیش­های خوزستان به ترتیب 240 روز و 1900 کیلوگرم تعیین گردیده است (2).

مطالعات اندکی در خصوص آلودگی به آناپلاسما مارژیناله در گاومیش رودخانه­ای در ایران در دسترس است. نتایج یک مطالعه در برزیل نیز نشان داده است که گاومیش آلوده به آناپلاسما مارژیناله می­تواند مخزن بیماری برای گاو باشد (21). به طور طبیعی در طی آلوده شدن بیماران به آناپلاسما مارژیناله، باکتری در درون اریتروسیت­های آلوده اولیه پس از تکثیر و اگزوسیتوز به اریتروسیت­های دیگر منتقل می­شود. اریتروسیت­های آلوده به واسطه فاگوسیتوز توسط سیستم رتیکولواندوتلیال خصوصاً طحال از گردش خون حذف می­شوند (4). همچنین، تاکنون مطالعه مولکولی که حضور آناپلاسما مارژیناله در طحال گاومیش را بررسی کرده باشد، یافت نشده است. اینکه گزارشی از بیماری بالینی آناپلاسموزیس در گاومیش رودخانه­ای در مقایسه با گاو (9) به ثبت نرسیده است، نظر به توضیحات ذکر شده این فرضیه از طرف نویسندگان مطرح است که ممکن است در گاومیش، طحال با فاگوسیتوز سریع گلبول‌های قرمز آلوده به آناپلاسما مارژیناله، فرصت تکثیر بیشتر و ایجاد بیماری بالینی به باکتری را ندهد. با پذیرش این فرضیه انتظار می­رود میزان آلودگی در طحال بیشتر از خون باشد. با توجه به موارد فوق، مطالعه حاضر با هدف بررسی مولکولی آلودگی به آناپلاسما مارژیناله به روش PCR و برخی شاخص­های هماتولوژیک آلودگی به این باکتری روی گاومیش­های ارجاعی به کشتارگاه اهواز انجام گرفت.

مواد و روش کار

در فاصله زمانی شهریور تا آذر 1396 با مراجعه به کشتارگاه دام اهواز، از تعداد 103 رأس گاومیش به­ظاهر سالم (36 رأس ماده و 67 رأس نر با محدوده سنی 1 تا 10 سال) به­صورت تصادفی پس از کشتار نمونه­گیری به­عمل آمد. دام­های تحت بررسی نیز بر اساس وضعیت شیری و دائمی بودن دندان­های ثنایا به دو دسته زیر 5/2 سال (شیری، نابالغ، 29 رأس) و بالای 5/2 سال (بالغ، 74 رأس) تقسیم شدند. بلافاصله پس از کشتار، از هر رأس دام یک نمونه خون اخذ شده و در دو لوله واجد ضد انعقاد EDTA جمع­آوری گردید. یکی از نمونه­های خون برای تهیه گسترش خونی و بررسی شاخص­های هماتولوژی در همان روز نمونه­گیری استفاده شد و دیگری جهت استخراج DNA تا زمان استخراج در دمای 20- درجه سانتی­گراد نگهداری شد.

پس از کشتار و باز شدن حفره بطنی طحال از حفره شکمی جدا و با استفاده از یک کارد پلاستیکی یک­بار مصرف، پس از برش در سطح طحال مقداری از بافت طحال تقریباً 1 سانتی­متر برداشت و به یک میکروتیوب 2 میلی­لیتری استریل منتقل گردید. نمونه‌های طحال نیز تا زمان انجام استخراج DNA در فریزر 20- درجه سانتی­گراد نگهداری شدند.

تهیه گسترش میکروسکوپی و ارزیابی شاخص­های هماتولوژی: گسترش­های خونی پس از رنگ آمیزی با گیمسا از نظر وجود اجرام آناپلاسمایی، با بزرگنمایی 1000، مورد بررسی میکروسکوپی قرار گرفتند. در هر گسترش خونی حداقل 20 میدان میکروسکوپی به­طور دقیق مورد مشاهده قرار ­گرفت. مقادیر شاخص­های هماتولوژی شامل تعداد تام گلبول­های سفید (WBC)، گلبول‌های قرمز (RBC)، حجم فشرده سلولی (PCV) و غلظت هموگلوبین (Hb) دام­های مورد مطالعه توسط دستگاه  Auto Hematology Analyser (BC-2800 Vet, China, Mindray) تعیین گردید.

استخراجDNA  و آزمایش PCR: استخراج DNA نمونه­های خون با استفاده از کیت (شرکت رها زیست پادتن، ایران) که برای تخلیص DNA ژنومی خون کامل به کار می­رود، طبق دستورالعمل انجام گرفت. استخراج DNA نمونه­های طحال با استفاده از کیت تجاری استخراج DNA از بافت Sina pure (سیناژن، ایران،PR8816113/EX6011) طبق دستورالعمل کیت انجام شد. نمونه­هایDNA  تا زمان انجام آزمایش PCR در دمای 20- درجه سانتی­گراد نگهداری شدند.

شناسایی آناپلاسما مارژیناله در نمونه­های DNA استخراج شده از خون و طحال با استفاده از تکثیر قطعه­ای از ژن groEL این باکتری و به روش PCR-Nested انجام گرفت (25). توالی پرایمرهای مورد استفاده مرحله اول و دوم PCR در جدول 1 آمده است.

واکنش PCR در دو مرحله انجام شد. مرحله اول در حجم 15 میکرولیتر و PCR مرحله دوم در حجم 25 میکرولیتر انجام شد. مقادیر و اجزای واکنش PCR مرحله اول شامل: 5/7 میکرولیتر مسترمیکس، 1 میکرولیتر پرایمر F1، 1 میکرولیتر پرایمر R1، 5/3 میکرولیتر آب مقطر و 2 میکرولیتر DNA استخراج شده بود. مقادیر مذکور در داخل یک میکروتیوب 2/0 میلی­لیتری مخلوط و به دستگاه ترموسایکلر گرادیانت (Eppendorf، آلمان( منتقل گردید.

واکنش PCR مرحله دوم در حجم 25 میکرولیتر انجام گرفت که اجزای واکنش حاوی: 5/12 میکرولیتر مسترمیکس، 25/1 میکرولیتر پرایمر F2، 25/1 میکرولیتر پرایمر R2، 9 میکرولیتر آب مقطر و 1 میکرولیتر محصول PCR مرحله اول بود. چرخه­های دمایی مرحله دوم PCR مشابه با مرحله اول بود با این تفاوت که فقط دمای اتصال پرایمر­ها برای سیکل سوم 68 درجه سانتی­گراد در نظر گرفته شد. سپس 7 میکرولیتر از محصول PCR هر نمونه روی ژل آگارز 1 درصد الکتروفورز شد. نمونه کنترل مثبت PCR از خون یک رأس گاو مبتلا به فرم بالینی آناپلاسما مارژیناله که واجد پارازایتمی شدید و مشخص در گسترش میکروسکوپی بود، استفاده شد. باند DNA با استفاده از اشعه UV توسط دستگاه ترانس لومیناتور مشاهده گردید.

تعیین توالیمحصول PCR: برای تأیید موارد مثبت  آناپلاسما مارژیناله در واکنش PCR، تعداد 2 نمونه از موارد مثبت محصولات PCR (یک نمونه مربوط به خون و یک نمونه طحال) برای تعیین توالی نوکلئوتیدی به شرکت تکاپو زیست ارسال گردید. پس از دریافت نتایج تعیین توالی، توالی مربوطه توسط نرم افزار Bio Edit مورد بررسی قرارگرفت و در نهایت توالی نوکلئوتیدی به دست آمده با توالی نوکلئوتیدی موجود در بانک ژنی  (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) NCBI  مورد مقایسه قرار گرفت.

تحلیل­های آماری: نتایج بدست آمده با استفاده از نرم‌افزار SPSS نسخه 17 انجام گرفت. به منظور بررسی رابطه سن و جنس با میزان آلودگی و رابطه میزان آلودگی در PCR خون با میزان آلودگی در PCR طحال و گسترش میکروسکوپی از آزمون­ مربع کای (Chi-square test) استفاده شد. مقایسه میانگین مقادیر شاخص‌های هماتولوژیک در دام­های آلوده و غیر آلوده با آزمون t مستقل (Independent sample t test) و نیز تعیین میزان توافق بین نتایج PCR خون با PCR طحال و گسترش میکروسکوپی از ضریب توافق کاپا (Kappa agreement) با درجه اطمینان 95درصد استفاده شد.

نتایج

نتیجه ارزیابی میکروسکوپی گسترش خونی103 نمونه خون گاومیش مورد مطالعه نشان داد که 16 رأس (5/15درصد) آلوده به اجرام شبه آناپلاسمایی بودند.

نتایج مولکولی و ارتباط آن با نتایج گسترش میکروسکوپی: در آزمایش مولکولی از 103 نمونه خون گاومیش، 32 نمونه (1/31درصد) مثبت بودند. همچنین 2 نمونه (9/1درصد) از 103 نمونه طحال گاومیش‌های مورد بررسی نیز در آزمایش PCR آناپلاسما مارژیناله مثبت شدند. محصول PCR مرحله دوم آناپلاسما به ­اندازه مورد انتظار و یک باند مشخص bp 866 بود (تصویر 1). دو رأس گاومیشی که در آزمایش PCR طحال مثبت بودند، نتیجه PCR خون آن­ها نیز مثبت گزارش گردید. از 32 رأس گاومیشی که در آزمایش PCR خون آلوده بودند، 9 رأس در آزمایش گسترش میکروسکوپی نیز واجد اجرام شبه آناپلاسمایی بودند. همچنین از بین 71 رأس گاومیشی که نتایج PCR خون آن­ها منفی بود، 7 رأس در آزمایش گسترش میکروسکوپی مثبت تشخیص داده شدند. آزمون مربع کای نشان داد که ارتباط معنی‌داری بین نتایج PCR خون و گسترش میکروسکوپی وجود دارد (03/0=P). همچنین آزمون توافق کاپا نیز توافق ضعیفی (22/0=Kappa) بین نتایج دو روش تشخیصی را نشان داد.

تعیین توالی محصول PCR: در جدول 1، نام گونه تأیید شده، عدد دسترسی در بانک ژنی و درصد شباهت باکتری­های مورد بررسی آمده است. دو توالی بررسی شده با توالی­های آناپلاسما مارژیناله از بانک ژن مذکور مطابقت داشتند. به گونه­ای که در مورد آناپلاسما مارژیناله مربوط به طحال، با توالی ثبت شده در بانک ژنی با شماره دسترسی KY523019.1، 99 درصد مشابهت و آناپلاسما مارژیناله مربوط به خون با توالی ثبت شده در بانک ژنی با شماره دسترسی KY522982.1، 100 درصد تشابه داشت.

نتایج شاخص­های خونی: مقایسه میانگین شاخص­های هماتولوژی PCV، HG، RBC و WBC بر اساس نتایج PCR خون و گسترش میکروسکوپی نشان داد که در دام­های آلوده و غیر آلوده تفاوت آماری معنی­داری مشاهده نگردید (05/0<P)، (جدول 2).

بحث

در مطالعه حاضر  گاومیش‌ها آلوده به گنجیدگی شبه آناپلاسمایی تشخیص داده شد. در مطالعه  Razmi و همکاران در سال 2006، بررسی گسترش خونی از160 رأس گاو، نشان داد که 4/19درصد به آناپلاسمامارژیناله آلوده بودند (17). مطالعه Rajaput و همکاران در سال 2005 از گسترش میکروسکوپی 250 رأس گاو و 250 رأس گاومیش در لاهور پاکستان به ترتیب 22 و 6/13درصد الودگی به آناپلاسما مارژیناله را نشان داد. Khan و همکاران در سال 2004 شیوع آناپلاسما مارژیناله توسط گسترش خونی در گاو را 3/17درصد و در گاومیش 13درصد به ثبت رسانده­اند. در هیچ یک از آلودگی­های فوق نشانه­های بالینی در گاومیش­ها گزارش نشده است. بررسی گسترش میکروسکوپی نمونه­های خون 150 رأس گاو از استان اصفهان، 6/10درصد آلودگی به آناپلاسمامارژیناله را نشان داد (15). نتایج تمام مطالعات ذکر شده در بالا از نظر میزان آلودگی تقریباً با نتیجه میزان آلودگی به روش گسترش میکروسکوپی در مطالعه موجود هم­خوانی دارد.

شیوع آناپلاسما مارژیناله در گاومیش در هند با استفاده از گسترش میکروسکوپی، صفر درصد گزارش شد (24).  میزان آلودگی گزارش شده در این مطالعه با میزان آلودگی در مطالعه حاضر مطابقت نداشت. صرف نظر از عوامل متعددی از جمله روش تهیه و رنگ­آمیزی گسترش، نوع مواد مورد استفاده و مهارت در تشخیص به این روش نیز ممکن است در تعیین میزان آلودگی اثرگذار باشد. نتایج مطالعه Vahora و همکاران در سال 2012 با مطالعه حاضر هم­راستا نبود (10،16،17). قطعاً چنین نتایجی که فقط با بررسی­های میکروسکوپی به دست آمده است از دقت کمتری برخوردار است، زیرا علاوه بر آن­که این روش در موارد مزمن بیماری و دام­های حامل پاسخگو نیست، بلکه ارگانیسم­های آناپلاسمایی فاقد ویژگی­های ریخت­شناسی متمایز کننده هستند و در میزان کم پارازیتمی ممکن است از اجسام هاول­جولی و یا رسوب رنگ قابل تفریق نباشند (3).

بررسی PCR به عنوان یک روش دقیق­تر جهت شناسایی و تفریق گونه­هایآناپلاسما در حیوانات حامل، نشان از حضور آلودگی به آناپلاسما مارژیناله در گاومیش­های مورد مطالعه فاقد علایم بالینی داشت. محققین متعددی از این روش جهت شناسایی و تفریق گونه­هایآناپلاسما در حیوانات حامل و نیز ناقلین کنه­ای استفاده نموده­اند (6،15،23). روشPCR  با پرایمرهایی از ژن اپران groEL برای تشخیص گونه­های آناپلاسما استفاده شده است (22). در این مطالعه نتایج آزمایش PCR نشان داد که نمونه­های خون و طحال آلوده به آناپلاسما مارژیناله بودند. Saetiew و همکاران در سال 2015 در تایلند میزان آلودگی گاومیش به آناپلاسما ماژیناله را 8 درصد تعیین کرده­اند. در یک بررسی به روش PCR در آفریقای جنوبی میزان آلودگی گاومیش­ به آناپلاسما مارژیناله 3/17درصد گزارش شده است (22). شیوع آناپلاسما مارژیناله با آزمایش Nested-PCR روی 500 رأس گاومیش در برزیل، 4/5 درصد تعیین شده است (20). مقادیر آلودگی به آناپلاسما مارژیناله در مطالعات فوق الذکر: 8 درصد (19)، 3/17درصد (22)، و 4/5 درصد (20) کمتر از مقدار آلودگی (1/31درصد) به روش PCR در مطالعه حاضر می­باشند. این اختلاف­ها ممکن است متأثر از تفاوت نژادی گاومیش­ها، استفاده از ژن­های متفاوت در PCR  و نمونه­گیری در فصول متفاوت باشد (14،19،22).

مطالعات نشان داده­اند که گاومیش می­تواند مخزن طبیعی عفونت به آناپلاسما مارژیناله ­باشد و نقش با اهمیتی در اپیدمیولوژی و انتشار آناپلاسموز در بین جمعیت گاوها داشته باشد (21). با توجه به میزان آلودگی قابل توجه 1/31 درصد گاومیش‌های کشتار شده در مطالعه حاضر، می­توان نقش احتمالی گاومیش به عنوان مخزنی قابل توجه برای حفظ عامل بیماری و انتقال آن به گاو مطرح باشد. میزان آلودگی گزارش شده به آناپلاسما مارژیناله با روش PCR در مطالعات انجام شده روی گاو توسط Noaman و Shayan در سال 2010، (6/38 درصد) و نیز Singh و همکاران در سال 2012، (2/45 درصد) بیشتر از مطالعه حاضر و حتی بیشتر از میزان آلودگی گاومیش در سایر مطالعات بود (20).

مطالعه ملکولی بافت طحال و خون گاومیش­های مورد مطالعه مثبت بودند. مطالعه مشابهی در ایران در زمینه PCR یا دیگر روش­های تشخیص بافتی برای آناپلاسما مارژیناله در گاو و گاومیش یافت نشد. اما در مطالعه Eddlestone و همکاران در سال 2006 که به صورت تجربی 4 قلاده سگ را به آناپلاسما پلاتیس آلوده کردند، با استفاده از PCR خون، طحال و مغز استخوان مشاهده شد که در 50 درصد موارد آناپلاسما پلاتیس ردیابی شد. یک فرضیه که در این مطالعه مطرح بود، نقش احتمالی طحال در تسریع فاگوسیتوز گلبول­های قرمز آلوده به باکتری و حذف سریع آن­ها از گردش خون قبل از تکثیر زیاد عامل بیماری در گلبول قرمز آلوده بود. محققین نقش پاسخ­های سایتوکاینی در مقاومت به آناپلاسموز در گاومیش را مرتبط دانسته­اند (13). در صورتی که میزان آلودگی در طحال بیش از آلودگی خون می­بود، نتایج می­توانست در پذیرفتن نقش احتمالی طحال در پیشگیری از بیماری بالینی کمک کننده باشند. با توجه به اینکه در مطالعه حاضر تعداد بسیار اندکی از نمونه­های طحال در مقایسه با نمونه‌های خون در آزمایش PCR، آلوده بودند، لذا چنین نقشی برای طحال مفروض نیست. تحقیقات نشان داده است که در طی فاز حاد ابتلا به آناپلاسما مارژیناله در گاو میزان پارازایتمی ممکن است فراتر از 109 اریتروسیت آلوده در هر میلی­لیتر خون برسد (11). میزان پارازایتمی در گاوهای حامل نیز از 103تا 105 اریتروسیت عفونی در هر میلی­لیتر خون گزارش شده است (4). این میزان در گاومیش­های آلوده بررسی نشده است. یک دلیل احتمالی دیگر که ممکن است گاومیش در مقابل گاو به بیماری مبتلا نشود این است که ممکن است میزان باکتریمی در گاومیش‌های مبتلا به حدی نرسد که منجر به بیماری بالینی شود.

نتیجه­ گیری: نظر به میزان آلودگی قابل توجه گاومیش­های کشتار شده به آناپلاسما مارژیناله، می­توان نقش احتمالی گاومیش به عنوان مخزن برای حفظ عامل بیماری و انتقال آن به گاو مطرح باشد. بنابراین، در خصوص ارتباط بین گونه آناپلاسما مارژیناله در گاومیش­ رودخانه­ای با گونه آلوده کننده و بیماریزای آن در گاو انجام مطالعات مولکولی مربوطه، ضروری به­نظر می­رسد. توصیه می­شود که در مطالعات آینده میزان باکتریمی با استفاده از مطالعات مولکولی کمی در گاوها و گاومیش­های آلوده حامل (به ظاهر سالم) مورد بررسی قرار گیرد.

سپاسگزاری

نویسندگان این مقاله مراتب تشکر و قدردانی خود را از معاونت پژوهشی دانشگاه شهید چمران اهواز بخاطر تأمین هزینه‌های این مطالعه که مستخرج از پایان نامه دوره دکتری عمومی دامپزشکی می­باشد، ابراز می‌نمایند.

تعارض منافع

بین نویسندگان تعارض در منافع گزارش نشده است.

 

جدول 1. توالی پرایمرهای ژن groEL استفاده شده برای شناسایی آناپلاسما مارژیناله در گاومیش­های تحت مطالعه.

پرایمر

توالی نوکلئوتیدی

AM265F1 (مرحله اول)

5'-GACTACCACATGCTCCATACTGACTG-3'

AMA424F2 (مرحله دوم)

5'-GTCTGAAGATGAGATTGCACAGGTTG-3'

AM1574R1 (مرحله اول)

5'-GACGTCCACAACTACTGCATTCAAG-3'

AM1289R2(مرحله دوم)

5'-CCTTTGATGCCGTCCAGAGATGCA-3'

*پرایمرهای F1 و R1  در مرحله اول و F2 و R2  در مرحله دوم PCR استفاده شدند.

جدول 2. مقایسه مقادیر (میانگین و انحراف معیار) برخی شاخص­های خونی گاومیش­های تحت مطالعه بر اساس نتایج PCR خون و گسترش میکروسکوپی.

       شاخص خونی

روش تشخیص

PCV

(درصد)

Hg

(گرم/دسی­لیتر)

RBC

(× 106/میکرولیتر)

 

WBC

(× 103/میکرولیتر)

 

PCR خون مثبت

5/7 ± 5/37

5/1 ± 10

1/1 ± 96/6

6/3 ±  2/9

PCR خون منفی

3/7 ± 9/38

9/1 ± 3/10

3/1 ± 2/7

8/3 ± 5/8

P Value

05/0<P

گسترش میکروسکوپی مثبت

6 ± 1/38

5/1 ± 1/10

1 ± 1/7

5/2 ± 5/7

گسترش میکروسکوپی منفی

7/6 ± 4/37

9/1 ± 1/10

4/1 ± 1/7

9/3 ± 1/9

P Value

05/0<P

تصویر 1. محصولPCR نمونه­های خون و طحال روی ژل آگارز 1درصد. چاهک­های شماره 1، 2 و 3 نمونه­های مثبت خون، چاهک شماره 4 نمونه کنترل مثبت، شماره 5 نمونه مثبت طحال، شماره 6 مارکر مولکولی bp100، شماره 7 کنترل منفی.

 

  1. Aubry, P., Geale, D.W. (2011). A review of bovine anaplasmosis. Transbound Emerg Dis, 58(1), 1-30. https://doi.org/10.1111/j.1865-1682.2010.01173.x
  2. Borghese, A. (2005) Buffalo production and research. (1st ed.) FAO of the United Nations, Rome, Italy. p. 1-5.
  3. Carelli, G., Decaro, N., Lorusso, A., Elia, G., Lorusso, E., Mari, V., Ceci, L., Buonavoglia, C. (2007). Detection and quantification of Anaplasma marginale DNA in blood samples of cattle by real-time PCR. Vet Microbiol, 124(1-2), 107-114.https://doi.org/10.1016/j.vetmic.2007.03.022
  4. Constable, P.D., Hinchcliff. K.W., Done, S.H., Grunberg, W. (2017). Veterinary Medicine. (11th ed.) Elsevier Ltd. Philadelphia, USA. p. 769-775.
  5. De La Fuente, J., Golsteyn Thomas, E.J., Van Den Bussche, R.A., Hamilton, R.G., Tanaka, E.E., Druhan, S.E., Kocan, K.M. (2003). Characterization of Anaplasma marginale isolated from North American bison. Appl Environ Microbiol, 69(8), 5001-5005. PMID: 12902301
  6. De La Fuente, J., Naranjo, V., Ruiz-Fons, F., Hofle, U., Fernandez de Mera, I. G., Villanua, D., Almazan, C., Torina, A., Caracappa, S., Kocan, K. M., Gortazar, C. (2005). Potential vertebrate reservoir hosts and invertebrate vectors of Anaplasma marginale and A. phagocytophilum in central Spain. Vector Borne Zoonotic Dis, 5(4), 390-401. https://doi.org/10.1089/vbz.2005.5.390
  7. Farhoomand, P. (2000). Buffalo Production. (2nd ed.) Urmia University Press, Urmia, Iran. p. 1-15.
  8. Inokuma, H., Fujii, K., Okuda, M., Onishi, T., Beaufils, J.P., Raoult, D., Brouqui, P. (2002). Determination of the nucleotide sequences of heat shock operon groESL and the citrate synthase gene (gltA) of Anaplasma (Ehrlichia) platys for phylogenetic and diagnostic studies. Clin Diagn Lab Immunol, 9(5), 1132-1136.‏ PMID: 12204973
  9. Jassem, G.A., Agaar, O.A. (2015). Molecular and biochemical study of Anaplasma marginale in cattle in Wassit province of Iraq. J Bacteriol Res, 7(4), 36-41.  https://doi.org/10.5897/JBR2014.0142
  10. Khan, M.Q., Zahoor, A., Jahangir, M., Mirza, M.A. (2004). Prevalence of blood parasites in cattle and buffaloes. Pak Vet J, 24(4), 193-194.‏
  11. Kieser, S.T., Eriks, I.S., Palmer, G.H. (1990). Cyclic rickettsemia during persistent Anaplasma marginale infection in cattle. Infect Immun, 58(4), 1117–1119. PMID: 2318532
  12. Kocan, K.M., De La Fuente, J., Guglielmone, A.A., Melendez, R.D. (2003). Antigens and alternatives for control of Anaplasma marginale infection in cattle. Clin Microbiol Rev, 16(4), 698–712. https://doi.org/10.1128/CMR.16.4.698-712.2003
  13. Mingala, C.N., Konnai, S., Cruz, L.C., Onuma, M., Ohashi, K. (2009). Comparative moleculo-immunological analysis of swamp- and riverine-type water buffaloes responses. Cytokine, 46(2), 273–282. https://doi.org/10.1016/j.cyto. 2009.02.006
  14. Mushtaq, A., Durranib, A.Z., Mushtaqa, A., Parveena, S., Raanaa, W., Rafiquea, R., Azeem, T., Umarc, S. (2015). Molecular diagnosis of bovine Anaplasmosis in district Lahore. Veterinaria, 1(1), 7-12.
  15. Noaman, V., Shayan, P. (2010). Comparison of microscopy and PCR-RFLP for detection of Anaplasma marginale in carrier cattle. Iran J Microbiol, 2(2), 89-94. PMID: 22347555
  16. Rajput, Z.I., Hu, S.H., Arijo, A.G., Habib, M., Khalid, M. (2005). Comparative study of Anaplasma parasites in tick carrying buffaloes and cattle. J Zhejiang Univ Sci B, 6(11), 1057- 1062.‏ PMID: 16252338
  17. Razmi, G.R., Dasrjerdi, K., Hosseini, H., Naghibi, A., Barati, F., Aslani, M.R. (2006). An epidemiological study on Anaplasma infection in cattle, sheep, and goats in Mashhad suburb, Khorasan province, Iran. Ann N Y Acad Sci, 1078, 479–481. https://doi.org/10.1196/annals.1374.089
  18. Rymaszewska, A., Grenda, S. (2008). Bacteria of the genus Anaplasma - characteristics of Anaplasma and their vectors: a review. Vet Med, 53(11), 573-584.
  19. Saetiew, N., Simking, P., Inpankaew, T., Wongpanit, K., Kamyingkird, K., Wongnakphet, S., Stich, R.W., Jittapalapong, S. (2015). Prevalence and genetic diversity of Anaplasma marginale infections in water buffaloes in Northeast Thailand. J Trop Med Parasitol, 38, 9-16.‏
  20. Silva, J.B., Vinhote, W.M.S., Oliveira, C.M.C., André, M.R., Machado, R.Z., da Fonseca, A.H., Barbosa, J.D. (2014a). Molecular and serological prevalence of Anaplasma marginale in water buffaloes in northern Brazil. Ticks Tick Borne Dis, 5(2), 100-104. https://doi.org/10.1016/j.ttbdis. 2013.09.007
  21. Silva, J.B., Fonseca, A.H., Barbosa, J.D., Cabezas-Cruz, A., de la Fuente, J. (2014b). Low genetic diversity associated with low prevalence of Anaplasma marginale in water buffaloes in Marajó Island, Brazil. Ticks Tick Borne Dis, 5(6), 801-804.‏ https://doi.org/10.1016/j.ttbdis.2014. 06.003
  22. Sisson, D., Hufschmid, J., Jolles, A., Beechler, B., Jabbar, A. (2017). Molecular characterisation of Anaplasma species from African buffalo (syncerus caffer) in kruger national park, South Africa. Ticks Tick Borne Dis, 8(3), 400-406. https://doi.org/10.1016/j.ttbdis.2017.01.003
  23. Torina, A., Galindo, R.C., Vicente, J., Di Marco, V., Russo, M., Aronica, V., Fiasconaro, M., Scimeca, S., Alongi, A., Caracappa, S., Kocan, K.M., Gortazar, C., de la Fuente, J. (2010). Characterization of Anaplasma phagocytophilum and A. ovis infection in a naturally infected sheep flock with poor health condition. Trop Anim Health Prod, 42(7), 1327-1331. https://doi.org/10.1007/s11250-010-9580-8
  24. Vahora, S.P., Patel, J.V., Patel, B.B., Patel, S.B., Umale, R.H. (2012). Seasonal incidence of haemoprotozoal diseases in crossbred cattle and buffalo in Kaira and Anand districts of Gujarat, India. Vet World, 5(4), 223-225.‏ https://doi.org/10. 5455/vetworld.2012.223-225
  25. Ybanez, A.P., Sivakumar, T., Ybanez, R.H.D., Ratilla, J.C., Perez, Z.O., Gabotero, S.R., Inokuma, H. (2013). First molecular characterization of Anaplasma marginale in cattle and Rhipicephalus (Boophilus) microplus ticks in Cebu, Philippines. J Vet Med Sci, 75(1), 27-36.‏ PMID: 22878542
  26. Yu, X.J., Zhang, X.F., McBride, J.W., Zhang, Y., Walker, D.H. (2001). Phylogenetic relationships of Anaplasma marginale and 'Ehrlichia platys' to other Ehrlichia species determined by GroEL amino acid sequences. Int J Syst Evol Microbiol, 51(3), 1143-1146.‏ PMID: 11414267
  27. Zeilstra-Ryalls, J., Fayet, O., Georgopoulos, C. (1991). The universally conserved GroE (Hsp60) chaperonins. Annu Rev Microbiol, 45, 301-325.‏ https://doi.org/10.1146/annurev. mi.45.100191.001505