نقش نیتریک اکساید در اختلالات گوارشی ناشی از تجویز تریاک در موش سوری

نوع مقاله: فارماکولوژی و سم شناسی

نویسندگان

1 دانش آموخته دانشکده دامپزشکی دانشگاه تهران، تهران، ایران

2 گروه علوم زیستی مقایسه‌ای، دانشکده دامپزشکی دانشگاه تهران، تهران، ایران

3 گروه علوم پایه، دانشکده دامپزشکی دانشگاه شهرکرد، شهرکرد، ایران

چکیده

زمینۀ مطالعه: بین فعالیت اوپیوئیدها و نیتریک‌اکساید در تنظیم حرکات روده‌ ارتباط وجود دارد.
هدف: بررسی نقش نیتریک‌اکساید در اختلالات گوارشی تریاک در موش.
روش‌کار: تعداد 36 موش‌ نر بالغ در شش گروه درمانی برای 5 روز متوالی با دوزهای افزایشی: 1) تریاک (6/0 ،5/0 ،4/0 ،3/0 ،2/0‌‌میلی گرم/30 گرم/روز)، 2)N -نیترو-L-آرژینین‌متیل‌استر‌‌(L-NAME) (20، 15، 10،  5/7، 5  میلی گرم/کیلوگرم/روز)، 3) ال-‌آرژینین (20-5 میلی گرم/کیلوگرم/روز)، 4) تریاک+L-NAME، 5)تریاک+ال-‌آرژینین و 6) آب‌مقطر تیمار شدند. در پایان تیمار، محوطه بطنی باز شدو قطعاتی از دئودنوم و قولون‌ابتدایی برای تعیین بیان ژن نیتریک‌اکساید‌سنتاز(NOS) و نیتریت بافتی، برداشته شد. همچنین قطعات حلقوی از قسمت‌های مختلف روده کوچک و بزرگ جدا شدند و برای ارزیابی حرکات به سامانه ارگان مجزا، انتقال یافتند. برای اندازه‌گیری بیان ژن‌ NOS از RT-PCR استفاده شد. علاوه بر این، تعداد30 حیوان برای سنجش انتقال مواد در روده‌ کوچک با ترکیب زغال‌چوب+‌صمغ، گاواژ شدند.
نتایج: تریاک سبب کاهش دامنه انقباضات در دوازدهه و ایلئوم شد، اما فرکانس انقباضات در دوازدهه و قولون میانی را افزایش داد (05/0P<). تریاک همچنین باعث افزایش بیان ژن NOS القایی، نورونی و اندوتلیالی را در قولون ‌ابتدایی افزایش شد، درحالیکه سبب کاهش بیان ژن NOS نورونی و اندوتلیالی در دئودنوم شد (05/0P<). همچنین، انتقال زغال‌چوب+‌صمغ در گروه دریافت کننده تریاک، به میزان 9/19 درصد در روده کوچک کاهش یافت، در حالیکه ال-‌آرژینین، این پیشروی را در روده کوچک افزایش، و ‌L-NAME آن را کاهش داد.
نتیجه‌گیری نهایی: تریاک سبب ایجاد اسپاسم عضلات صاف و در نتیجه کاهش حرکات روده می‌شود. تغییرات بیان ژن NOS ممکن است یک مکانیسم‌ جبرانی در برابر اختلالات گوارشی ناشی از مصرف تریاک باشد.

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

The Role of NO in the Opium-Induced Bowel Dysfunction in the Mice

نویسندگان [English]

  • Amin Dabili Nasrabadi 1
  • Hossein Ali Arab 2
  • Syyed Ahmad Fatemi Ardestani 2
  • Hossein Hassanpor 3
1 Graduated from the Faculty of Veterinary Medicine, Tehran University, Tehran, Iran
2 Department of Comparative Biosciences, Faculty of Veterinary Medicine, University of Tehran, Tehran, Iran
3 Departments of Basic Sciences, Faculty of Veterinary Medicine, University of Shahrekord, Iran
چکیده [English]

BACKGROUND: Opioids and nitric oxide (NO) are functionally linked in the regulation of intestinal motility.
OBJECTIVES: To investigate the role of NO in the opium induced bowel dysfunction in mice.
METHODS: Sixty-six male mice received incrementally doses of the following treatments in six groups for 5 consecutive days: 1) Opium (0.2, 0.3, 0.4, 0.5 and 0.6mg/30g/day), 2) N-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME, 5,7.5,10,15 and 20mg/kg/day), 3) L-arginine (5-20mg/kg/day), 4) Opium+L-NAME, 5) Opium+L-arginine and 6) distilled water. At the end of the treatment, the abdomen was opened; some pieces of duodenal and proximal colon were taken to determine NO synthase (NOS) expression and nitrite levels, and some isolated rings from those parts of small and large intestine were prepared and transferred to the organ bath system to study intestinal motility. RT-PCR was used to determine the NOS gene expression. To determine the small intestinal transit, 30 mice in six groups, were used for oral administration of charcoal+gum in vivo.
RESULTS: Opium decreased amplitude of the duodenum and ileum contractions, but increased frequency of duodenal and mid colon contractions (P<0.05). While the gene expression of inducible, neuronal and endothelial NOS was increased in colon (P<0.05), a reduced neuronal and endothelial NOS gene expression was shown in duodenum. The charcoal+gum transit was decreased in opium-treated animals compared to the control group (19.9%). However, L-arginine increased this transit while L-NAME decreased it.
CONCLUSIONS: Opium induced intestinal smooth muscle spasms, which result in the decreased intestinal movements. The alterations in NOS gene expression may be a compensation mechanism against opium-induced intestinal dysfunction.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Opium
  • nitric oxide
  • mice
  • Intestine
  • Isolated organ

مقدمه


از دوران باستان تریاک و سایر اوپیوئیدهای مشتق شده از آن به عنوان مؤثرترین داروهای ضد‌درد برای انجام اعمال جراحی شناخته شده‌اند، اما استفاده از این ترکیبات با عوارض جانبی متفاوتی از جمله اختلال در عملکرد دستگاه گوارش همراه است و می‌تواند مصرف آن را در بیماران محدود کند (14،21). شواهد حاکی است که تأخیر در تخلیه معده، افزایش بیماری ریفلاکس معده، مدفوع خشک، احتباس گاز و تخلیه ناقص محتویات دستگاه گوارش از عواقب معمول اختلالات روده‌ای ناشی از مصرف مواد مخدر می‌باشد (9،7). یبوست شایع‌ترین اختلالات دستگاه گوارش است که به طور گسترده‌ای در میان بیماران دریافت‌کننده اوپیوئیدها دیده می‌شود (7،13). اوپیوئیدهای خارجی سبب کاهش حرکات بخش‌های مختلف دستگاه گوارش، از جمله روده کوچک و روده‌ی بزرگ می‌شوند (8،13). مطالعات نشان می‌دهد که نیتریک‌اکساید می‌تواند در ایجاد عوارض جانبی مواد مخدر در دستگاه گوارش دخیل باشد (3،23).

نیتریک‌اکساید (NO) یک ملکول گازی شکل ساده است که از اسید آمینه ال-‌‌آرژینین ساخته می‌شود. خانواده آنزیمی که مسئول بیوسنتز نیتریک‌اکساید است، به نیتریک‌اکساید ‌سینتاز (NOS) معروف است که دارای سه ایزوفرم نورونی (nNOS)، القایی (iNOS) و اندوتلیالی (eNOS) می‌باشد. انواع مختلفی از مهار کننده‌های NOS وجود دارند که می‌توانند تولید این گاز را در بدن مهار کنند، که از ‌جمله می‌توان به آنالوگ‌های ال-آرژینین اشاره نمود. از آنالوگ‌های ال-‌آرژینین می‌توان N-نیترو-L-آرژینین متیل استر (L-NAME) را نام برد که به شکل رقابتی با ال-‌آرژینین، فعالیت‌های آنزیم‌های NOS را مهار می‌کنند (11). نیتریک‌اکساید از واسطه‌های مهم فیزیولوژیک و پاتوفیزیولوژیک در موجودات زنده می‌باشد که نقش گسترده ای در فرآیندهای طبیعی بدن ایفا می‌کند (17). این ماده در دستگاه گوارش حضور فعالی دارد و به عنوان یک انتقال دهنده عصبی مهاری نقش مهمی در تنظیم حرکات قسمت‌های مختلف لوله گوارش بر عهده دارد (30).

مطالعات زیادی، ارتباط و همبستگی بین مسیر‌های وابسته به NO و سیستم اوپیوئیدی در تنظیم فعالیت‌های جنسی و مقاربت، فعالیت‌های قلبی و عروقی، فعالیت‌های دستگاه گوارش و تحمل و وابستگی به مواد مخدر را نشان داده‌اند (18،28). عوارض ناشی از اوپیوئیدها در قسمت‌های مختلف دستگاه گوارش، متفاوت است. این ماده، علاوه بر مهار حرکات خود به خودی روده‌ها، سبب توقف حرکات دستگاه گوارش و ایجاد اسپاسم تونیک در روده انسان و سایر گونه‌ها می‌شود. این اثر مهار کننده حرکات و کاهش قدرت عضلانی روده، ممکن است ناشی از کاهش تولید یا آزاد شدن نیتریک اکساید از عصب‌های مهاری (13) و فعال‌شدن مستقیم گیرنده‌های اوپیوئید در سلول‌های عضلانی باشد (8،25). انقباض عضلات حلقوی ایلئوم موش سوری ناشی از تجویز مورفین با مهار آزادسازی نیتریک‌اکساید از اعصاب دستگاه گوارش همراه بوده است (15)، مطالعات همچنین نشان می‌دهد که گیرنده تازه کشف شده‌ی 3µ اوپیوئیدی، در سنتز NO دخالت دارد (4،10). علیرغم ارتباطات مشاهده شده بین اوپیوئیدها و نیتریک اکساید در دستگاه گوارش، هنوز مشخص نیست که چگونه نیتریک‌اکساید در فرآیندهای مولکولی با اوپیوئیدها تعامل دارد. در مطالعه حاضر، نقش NO در اختلالات حرکتی روده‌ای ناشی از تریاک و ارتباط آن با تغییر انتقال مواد با واسطه اوپیوئیدها در روده، بررسی شده است.

مواد و روش کار

حیوانات و گروه های تیمار: برای انجام این مطالعه از 66 موش نر بالغ نژاد Balb C دارای محدوده وزنی30-25 گرم استفاده شد. حیوانات در شرایط نوری ثابت (12 ساعت نور و 12 ساعت تاریکی)، دمای اتاق با دسترسی آزاد به آب و مواد غذایی کافی قرار داشتند. دستورالعمل پژوهش حاضر بر اساس مفاهیم اخلاقی اصول کار با حیوانات آزمایشگاهی، طراحی و پیروی شد. حیوانات در قفس‌های استاندارد مخصوص موش سوری در مکان بهداشتی و تمیز نگهداری می‌شدند. حیوانات بر اساس نوع درمان به صورت تصادفی برای دو بخش آزمایشات برون‌تنی و درون‌تنی استفاده شدند. برای انجام آزمایشات برون‌تنی تعداد 36 موش به شش گروه 6 تایی و برای آزمایشات  اندازه گیری زمان انتقال مواد در طول روده گوارش، به شش گروه 5 تایی‌ تقسیم شدند.

نحوه تیمار حیوانات در گروه های آزمایشی بخش اول آزمایش به شرح زیر بوده است:

گروه ا) حیوانات با دوز‌های افزایشی  تریاک به میزان  1/0، 15/0، 2/0، 25/0 و 3/0 میلی لیتر، که هر میلی لیتر حاوی  2 میلی گرم تریاک بود و بازای هر  30 گرم وزن بدن موش، یک‌بار در روز و به مدت 5 روز از راه داخل صفاقی تیمار شدند. تریاک از ستاد فرماندهی پلیس مبارزه با مواد مخدر ناجای جمهوری اسلامی ایران به صورت رسمی تهیه گردید.

گروه 2): در این گروه، ال-نیم ( ,L-NAMEسیگما آلدریچ، ایالات متحده آمریکا) با دوز افزایشی 5، 5/7، 10، 15و20 میلی گرم بر کیلوگرم وزن حیوان،  یکبار در روز و به مدت 5 روز، به صورت داخل صفاقی تزریق شد.

گروه 3): حیوانات از ماده ال-‌آرژینین (سیگما آلدریچ، ایالات متحده آمریکا) با دوز افزایشی 5، 5/7، 10، 15و20 میلی گرم بر کیلوگرم وزن حیوان، روزانه به مدت 5 روز داخل صفاقی دریافت کردند.

گروه 4): به حیوانات این گروه، ترکیب تریاک+L-NAME را با روش و دوزهای اعلام شده در گروه های قبلی، تزریق شد. 

گروه 5) در این گروه حیوانات ترکیب تریاک+ال-‌آرژینین را با همان روش و دوزهای اعلام شده در گروه های قبلی دریافت کردند

گروه 6) به حیوانات این گروه که به عنوان کنترل انتخاب شده بودند،  آب مقطر استریل با حجم افزایشی  1/0، 15/0، 2/0، 25/0 و 3/0 میلی لیتر روزانه یک ‌بار به صورت داخل صفاقی و به مدت 5 روز متوالی دریافت کردند.

به منظور اطمینان از ایجاد وابستگی، چند حیوان به طور تصادفی انتخاب شدند، وسپس به آن‌ها 2 میلی گرم نالوکسان (سیگما آلدریچ، ایالات متحده آمریکا) به ازای هر موش بصورت داخل صفاقی، تزریق شد. بروز علائم سندرم ترک در این حیوانات نشان دهنده ایجاد وابستگی بود (29).

در بخش اندازه گیری زمان عبور مواد ترکیبی از زغال فعال (شرکت نوریت  هلند) و صمغ عربی (سیگما آلدریج، ایالات متحده آمریکا) به به میزان 100 میلی گرم از هر ترکیب و در حجم یک میلی لیتربه  موش‌های تحت درمان داخل معده گاواژ شد.

 نمونه برداری: در پایان درمان، تمام حیوانات در گروه‌های مختلف تیمار با استفاده از ماده هوش بر ایزوفلوران (سیگما آلدریچ، ایالات متحده آمریکا) بیهوش شدند و سپس به روش مرگ آسان کشته شدند. بلافاصله از قلب آن‌ها به میزان1- 5/0 میلی لیترخون،‌ اخذ شد و سپس محوطه شکمی باز شد و لوله گوارش حیوانات جدا و بیرون آورده شد. پس از شست و شوی روده و جداسازی بافت‌های همبند همراه آن‌ها، قطعاتی از دئودنوم، ژژنوم، ایلئوم، قولون‌ابتدایی (1 سانتی‌متر بعد از سکوم)، قولون‌میانی، قولون‌انتهایی (1 سانتی متر بالای مقعد)، برای بررسی فعالیت‌های حرکتی لوله گوارش جدا و به محلول کربس انتقال داده شد و تا انجام آزمایش در یخچال 4 درجه سانتی‌گراد نگهداری شد. قسمتی از بافت‌های نام برده شده برای اندازه‌گیری نیتریت بافت و اندازه‌گیری بیان‌ژن NOS از بدن حیوان جدا و ابتدا به تانک ازت مایع و سپس به فریزر 70- درجه سانتی‌گراد منتقل گردید و تا زمان انجام آزمایشات نگهداری شد. خون‌های اخذ شده از قلب نیز بلافاصله به مدت 10 دقیقه با دور 4000 در دقیقه، سانتریفیوژ و سرم حاصل در فریزر 70- درجه سانتی گراد نگهداری شد.

ثبت حرکات بافت ایزوله بدنبال تیمارهای دارویی: قطعات ایزوله به طول 1 سانتی‌متر از دئودنوم، ژوژنوم، ایلئوم، قولون‌ابتدایی، قولون‌میانی، قولون‌انتهایی در جهت فیبر‌های عضلات صاف طولی در داخل حمام بافتی حاوی محلول کربس-هنسلیت 37 درجه سانتی‌گراد (شامل 120میلی مولارکلرید سدیم، 9/5 میلی مولارکلرید پتاسیم، 2/1میلی مولار کلرید منیزیم، 2/1میلی مولار فسفات سدیم، 15 میلی مولاربیکربنات سدیم، 11میلی مولارگلوکز و 8/1 میلی مولارکلرید کلسیم) که با گاز کربوژن (95 درصد اکسیژن و 5 درصد دی اکسید کربن) هوادهی می‌شد، معلق گردیدند و به یک مبدل نیرو متصل شدند. بافت‌ها تحت 1-5/0 گرم کشش قرار گرفتند و خروجی فعالیت مکانیکی بافت ایزوله با استفاده از سیستم پاور لب (آدم اینسترومنتز، استرالیا) تقویت و توسط ثبت کننده کامپیوتری ثبت شد. ابتدا به مدت 60 دقیقه به نمونه‌ها فرصت داده شد تا به مرحله تعادل برسند که در این مدت محلول کربس هر 15 دقیقه یک‌بار تعویض ‌گردید. بعد از برقراری تعادل، انقباضات به مدت 10 دقیقه ثبت شد. میانگین تواتر انقباضات هر قطعه بر حسب تعداد انقباضات در 20 ثانیه محاسبه شد. میانگین دامنه انقباضات نیز با اخذ میانگین از اختلاف بیشینه (ناشی از پتاسیم کلراید) و کمینه کشش (ناشی از پالس الکتریکی) قطعات روده مجزا محاسبه شد. برای ارزیابی میزان پاسخ‌دهی سیستم غیر‌آدرنرژیک–غیرکولینرژیک روده از تحریک میدان الکتریکی به وسیله‌ی سامانه تحریک میدان الکتریکی (شرکت نیرو محرکه، آمریکا) بهره گرفته شد. بدین منظور، ابتدا قطعات بافتی توسط آتروپین سولفات با غلظت‌های 6-10 مولار برای روده‌ کوچک و 7- 10 مولار برای روده بزرگ، پروپرانولول هیدروکلراید با غلظت 5-10 مولار برای روده‌ کوچک و 6-10 مولار برای روده بزرگ، فنتول آمین 5-10 مولار برای روده‌ کوچک و 7-10 مولار برای روده بزرگ، به مدت 10 دقیقه پیش تیمار شدند (سیگما آلدریچ، ایالات متحده آمریکا). سپس یک انقباض حداکثری با پتاسیم کلراید در غلظت 4-10 مولار برای روده‌ها و 5-10 مولار برای قولون ایجاد شد. هنگامی که پاسخ انقباضی به کفه رسید، تحریک میدان الکتریکی (v50‌، 10هزارم ثانیه با تأخیر ms 3 هزارم ثانیه، 8 هرتز برای10 ثانیه) با قرار دادن الکترود‌هایی در دو سمت بافت مجزا در داخل حمام بافت، انجام شد. غلظت‌های آگونیست‌ها و آنتاگونیست‌های به کار رفته در این پژوهش، براساس EC50 بدست آمده از تکرار آزمایشات اولیه، محاسبه شد (1،15،18).

اندازه‌گیری مقدار نیتریت در سرم و بافت: اندازه‌گیری نیتریت به منظور تعیین مقدارNO آزاد شده در خون و بافت روده به روش گریس انجام شد. در این روش ابتدا نیترات سرم توسط کادمیوم به نیتریت تبدیل شد، سپس میزان نیتریت کل اندازه‌گیری گردید. به منظور جدا کردن پروتئین از سرم، نمونه‌ها ابتدا با سولفات‌روی و سپس با سود مخلوط و سانتریفیوژ شد. سپس مایع رویی برداشته شد و با120 میلی لیتر بافر گلیسین مخلوط شد. پس از اضافه کردن کادمیوم گرانول به محلول، 5 دقیقه تکان داده و بعد از بیرون آوردن گرانول کادمیوم از محلول، 150 میلی لیترسولفانیل آمین و 150 میلی لیترمعرف گریس به آن اضافه گردید. برای تعیین مقدار نیتریت موجود، از دستگاه الایزا ریدر (مدل6305، انگلستان) استفاده شد. با قرائت میزان جذب نوری نمونه‌های در طول موج 540 نانومتر میزان نیتریت مورد ارزیابی قرار گرفت. برای اندازه‌گیری میزان NO بافت‌های جدا شده بر حسب میکرومول بر میلی‌گرم پروتئین تام، ابتدا بافت جدا شده با دستگاه اولتراسوند (شرکت فناوری ایرانیان پژوهش نصر)، لیز و به مایع بافتی تبدیل شد. سپس تمام مراحل بالا بجز مخلوط کردن و شستشوی محلول بافتی با کادمیوم، تکرار گردید. همچنین پروتئین تام هر نمونه بافتی با استفاده از روش برد‌فورد اندازه‌گیری شد. تمام ترکیبات و داروهای مورد استفاده از شرکت سیگما آلدریچ، ایالات متحده آمریکا تهیه شد (11).

اندازه‌گیری زمان عبور مواد از روده کوچک: مقدار مخلوط اعلام شده از زغال فعال (شرکت نوریت  هلند) و صمغ عربی (سیگما آلدریج، ایالات متحده آمریکا) به موش‌های تحت درمان داخل معده گاواژ شد. بعد از گذشت 30 دقیقه، حیوانات با مرگ آسان کشته شدند، سپس، لوله گوارش از معده تا سکوم بیرون آورده شد و به صورت عمودی در روی سطح صاف، آویزان شد. فاصله‌ای که زغال به همراه غذا از معده در طول روده‌ی کوچک طی کرده، نسبت به کل طول روده کوچک برای هر موش جداگانه اندازه‌گیری و ثبت شد. سپس، با استفاده از فرمول زیر درصد حرکت مواد در روده‌ی کوچک مورد ارزیابی قرار گرفت (24).

100 × طول کل روده کوچک / میزان پیشرفت زغال و صمغ = درصد جابه جایی مواد

اندازه‌گیری بیان ژن NOS: برایاستخراج  RNAتام از بافت‌های دئودنوم و قولون ابتدایی از کیت استخراج RNA (کیت سیناژن، ایران) مطابق با دستورالعمل کارخانه سازنده استفاده شد. سپسبا استفاده از RNA استخراج شده برای تولید cDNA از کیت مخصوص سنتز cDNA (شرکت کیاژن، Cat No:RR820L، ایالات متحده آمریکا) مطابق با دستورالعمل مربوطه، استفاده گردید. محلول نهایی حاویDNA  جهت آزمایشات بعدی، در دمای 20- درجه سانتی گراد نگهداری گردید. پرایمرهای مورد نظر با استفاده از نرم افزار Primer Blast قابل دسترس در شبکه اینترنت NCBI، طراحی شد. پرایمرها بعد از طراحی، با کل ژنوم حیوان (موش سوری) مورد مقایسه قرار گرفت، تا بدین وسیله از اختصاصات پرایمرها برای نواحی مکمل خود اطمینان حاصل شود.برای هر نمونه حاوی DNA حاصل از مرحله قبل، ابتدا 5 ماکرولیتر رنگ اینترکاله Syber-Green (محصول شرکت بیوتکنولوژی تاکارا، ژاپن، RR820 L) در داخل میکروتیوب 5/0میلی لیتری، ریخته شد.سپس پرایمر‌های اختصاصی Reverse و Forward مربوط به ژن‌های eNOS iNOS, و nNOS که 6/0 ماکرولیتر از پرایمر و 6/0 ماکرولیتر از cDNA استخراج شده بود، به محلول اضافه شد. بعد از مخلوط کردن مواد فوق در میکروتیوب، حجم مخلوط با اضافه کردن آب مقطر یونیزه، به 10ماکرولیتر رسانده شد، و سپس در دستگاه ترموسایکل (روتورژن کیو مدل 6000، ساخت شرکت کیاژن، ایالات متحده آمریکا) قرار داده شد.برای تجزیه و تحلیل داده‌های Real time-PCR از نرم افزار LinRegPCR ویرایش 2012 به منظور محاسبه‌ی میزان راندمان یا بهره‌وری برای هر ژن، استفاده شد (11).

تجزیه و تحلیل آماری داده‌ها: داده‌ها با استفاده از نرم افزار آماری SPSS ویرایش 25 تجزیه و تحلیل شدند. برای مقایسه‌ی میانگین تواتر و دامنه انقباضات و سنجش نیتریت از آزمون آنالیز واریانس یک‌طرفه و ضریب همبستگی پیرسون، با در نظر گرفتن اختلاف معنی‌دار پنج صدم، استفاده شد. داده‌های مربوط به بیان ژن پس از محاسبه نسبت بیان ژن‌ها، با آزمون آماری یک طرفه ANOVA و تست تکمیلی Tukey، مورد ارزیابی قرار گرفتند. در صورت وقوع سطح معنی‌داری کمتر از (05/0P<) اختلاف معنی‌دار تلقی شد. تمام نتایج به صورت Mean±SD و در نمودار‌ها  Error bars: %95CLدرج گردید  (11،15،18،24).

نتایج

اثرات تریاک بر حرکات بافت روده ایزوله و نقشNO : داده‌های مربوط به دامنه و فرکانس انقباضات عضله صاف روده‌ها در جدول 1 آنالیز شده است. همان‌طوری‌که جدول نشان می‌دهد، تریاک به طور معنی‌داری سبب کاهش دامنه انقباضات بر حسب گرم در دوازدهه (از 6/20 ± 1/83 به 2/11 ± 1/48، 01/0(P< و ایلئوم (از 7/18 ± 8/75 به 5/14 ± 1/50، 05/0P<) شد. اما دامنه انقباضات در گروه تریاک+ال-‌آرژینین به طور معنی‌داری (001/0P<) در ایلئوم موش‌های تحت درمان نسبت به گروه تریاک، افزایش داشته است.  تجویز  L-NAME  به همراه تریاک، سبب کاهش دامنه انقباضات در بافت‌های جمع آوری شده از قولون‌انتهایی شد (از 4/66 ± 4/290 به 63 ± 9/142). همچنین، تریاک سبب افزایش معنی‌دار فرکانس انقباضات در بافت‌های جمع آوری شده از دوازدهه (از 1/61 ± 3/533 به 3/93 ± 3/634، 05/0P<) و قولون‌میانی (از  2/66 ± 9/196 به 9/235 ± 3/480، 01/0P<) شد. اما این اثر با تجویز ال-‌آرژینین در قولون‌میانی ​​(از 9/235 ± 3/480 به 9/40 ± 3/152، 01/0P˂) و قولون‌انتهایی (از 2/77 ± 6/272 به 3/30 ± 8/144، 05/0P<) کاهش یافت.

میزان بیان ژن نیتریک اکساید سنتاز القایی (iNOS): نتایج این مطالعه نشان داد که میزان بیان ژن iNOS در دئودنوم گروه دریافت کننده تریاک از گروه‌های دریافت کننده آب مقطر، L-NAME، ال-‌آرژینین، تریاک+ L-NAMEو تریاک+ال-‌آرژینین بیشتر بوده است (001/0P<). همچنین، میزان بیان ژن در گروه تریاک+ L-NAMEاز گروه شاهد (05/0P<) و L-NAME (01/0P<) نیز بیشتر بوده است. درحالیکه این افزایش بیان ژن iNOS، را هم در بافت قولون ‌ابتدایی حیوانات دریافت کننده تریاک نسبت به گروه شاهد، تریاک+ L-NAMEو تریاک+ال‌-آرژینین،  در سطح معنی‌داری (001/0P<) شاهد بودیم. آنالیز آماری داده‌های مربوط به نسبت بیان ژن نیتریک اکساید سنتاز القایی (iNOS) به بیان ژن کنترل داخلی RPLP0 (Ribosomal protein lateral stalk subunit P0)، در بافت دئودنوم و قولون ابتدایی موش سوری، در نمودار 1 قابل مشاهده است.

میزان بیان ژن نیتریک اکساید سنتاز نورونی (nNOS): میزان بیان ژن nNOS بافت دئودنوم در گروه درمان شده تریاک نسبت به گروه درمان شده با آب مقطر و ال-‌آرژینین کمتر بوده است (001/0P<). این بیان درگروه دریافت کننده تریاک+ L-NAME نسبت به گروه‌های دریافت کننده آب مقطر و ال-‌آرژینین نیز کمتر بوده است (001/0P<). همچنین، بیان ژن در بافت‌های روده گروه درمان شده با تریاک+ال-‌آرژینین از گروه شاهد و درمان شده با ال-‌آرژینین در سطح معنی‌داری (001/0P<) کمتر بود. اما در بافت قولون، میزان بیان ژن در گروه درمان شده با تریاک، به طور معنی‌داری (001/0P<) از بقیه گروه‌ها بیشتر بوده است. این افزایش بیان ژن را در گروه درمانی تریاک+ال-‌آرژینین نسبت به گروه شاهد (05/0P<)، L-NAME (001/0P<)، ال-‌آرژینین (01/0P<) و تریاک+L-NAME (001/0P<) نیز شاهد بوده‌ایم. آنالیز آماری داده‌های بیان ژن nNOS در بافت‌های دئودنوم و قولون ابتدایی موش‌های سوری درمان شده با تریاک و دیگر مواد تست شده، در نمودار 2 قابل مشاهده است.

میزان بیان ژن نیتریک اکساید سنتاز اندوتلیالی (eNOS): میزان بیان ژن eNOS در بافت دئودنوم گروه درمان شده با تریاک، کاهش معنی‌داری نسبت به گروه‌های شاهد (01/0P<)، ال-‌آرژینین (001/0P<)، تریاک+ال-‌آرژینین (001/0P<)، نشان داد. این کاهش در بیان ژن eNOS همچنین، در گروه تریاک+L-NAME در سطح معنی‌داری (001/0P<) از گروه شاهد، ال-‌آرژینین و تریاک+ال-‌آرژینین نیز نشان داده شد. اما، بیان ژن این آنزیم، در بافت قولون ابتدایی گروه درمان شده با تریاک به طور معنی‌داری (001/0P<) از بقیه گروه‌ها بیشتر بوده است. تغییرات مربوط به بیان ژن نیتریک اکساید سنتاز اندوتلیالی (eNOS) در بافت‌های دئودنوم و قولون ابتدایی موش سوری در نمودار 3 قابل مشاهده است. 

میزان تغییرات نیتریک اکساید در سرم و بافت‌های روده: نتایج این مطالعه نشان داد که میزان نیتریت درسرم گروه‌های تحت درمان با یکدیگر تفاوت معنی‌داری نداشت، اما میزان نیتریت اندازه‌گیری شده در بافت‌های گروه‌های مختلف درمانی، با یگدیگر اختلاف داشتند. تغییرات سطح نیتریت بافت‌های لوله گوارش موش‌های درمان شده با تریاک و دیگر مواد تجویز شده، در نمودار 4  قابل مشاهده است. همان‌طوری‌که این نمودار نشان می‌دهد، میزان نیتریت بافتی در دئودنوم گروه درمان شده با تریاک به طور معنی‌داری با گروه‌های L-NAME (001/0P<) و تریاک+ L-NAME (05/0P<) اختلاف داشته، اما با گروه شاهد تفاوت معنی‌داری نداشت. همچنین، میزان نیتریت در گروه درمان شده با تریاک+ال-‌آرژینین از گروه‌های شاهد، L-NAME (001/0P<) و تریاک+L-NAME (01/0P<) بیشتر بوده است، همانطورکه میزان نیتریت بافت قولون در گروه دریافت کننده تریاک، از گروه درمانی L-NAME، بیشتر بود (05/0P<)، اما با گروه‌های شاهد و ال-‌آرژینین، تفاوت معنی‌داری نداشت.

میزان پیشروی زغال+‌صمغ در روده موش سوری: خلاصه آنالیز، مطالعه مرتبط با اندازه‌گیری درصد پیشروی زغال+صمغ در روده گروه‌های مختلف آزمایشی در نمودار 5  نشان داده شده است. همان‌طوری‌که این نمودار نشان می‌دهد، میزان پیشروی ترکیب زغال+‌صمغ در روده‌ی کوچک موش‌های دریافت کننده تریاک، کاهش معنی‌داری (001/0P<) در مقایسه با گروه‌های شاهد، L-NAME و ال-‌آرژینین، داشته است. اما تجویز ال- آرژینین به همراه تریاک به طور معنی‌داری (001/0P<)  باعث مهار کاهش پیشروی ترکیب زغال+صمغ در روده موش‌ها شد. اما میزان حرکت زغال+صمغ در روده‌های موش های دریافت کننده تریاک+ L-NAMEنسبت به گروه آزمایشی L-NAME و ال-‌آرژینین، به طور معنی‌داری کاهش داشته است (001/0P<).

بحث

هدف از مطالعه حاضر بررسی نقش نیتریک ‌اکساید در اختلالات حرکتی لوله گوارش ناشی از مصرف تریاک در موش‌های وابسته شده به تریاک بوده است.نتایج این مطالعه نشان داد که دامنه انقباضات و میزان شل شدگی عضلات صاف روده بعد از ایجاد پالس الکتریکی در گروه‌ درمان شده با تریاک در مقایسه با گروه شاهد، کاهش معنی‌داری داشته است. اما با تجویز اسید آمینه ال-آرژینین که به عنوان پیش ساز NO شناخته شده است سبب مهار این کاهش گردید، در حالیکه، تجویز مهار کننده تولید NO، یعنی L-NAME میزان کاهش را افزایش داد. نتایج حاصل از اندازه گیری فرکانس انقباضات قسمت‌های مختلف روده نشان داد که  در گروه دریافت کننده تریاک میزان این شاخص حرکتی افزایش داشته است که این تغییرات با تجویز ال-آرژینین مهار شد ولی با مصرف داروی L-NAME میزان آن بیشتر شد. میزان این تغییرات در دامنه و فرکانس قولون بیشتر از روده کوچک بوده است. این مطالعه همچنین حاکی است که مصرف تریاک باعث کاهش پیشروی ترکیب زغال+صمغ در روده می‌شود  که مصرف ال-آرژینین می‌تواند میزان پیشروی را افزایش ولی L-NAME آن را کاهش دهد. تعیین مقدار متابولیت نیتریک اکساید یعنی نیتریت که شاخصی برای تولید NO در سرم و بافت‌های روده موش‌های تحت درمان است، نشان داد که میزان تولید این متابولیت در بافت دئودنوم موش‌های دریافت کننده تریاک بیشتر از بافت قولون بوده اما میزان آن در گروه‌های مختلف درمانی، اختلاف معنی‌داری را نشان نداد. اما مصرف همزمان ال-آرژینین با تریاک سبب افزایش میزان این متابولیت در بافت روده شد. این در حالی است که بیان ژن NOS القایی در گروه دریافت کننده تریاک در بافت قولون و دئودنوم افزایش داشته است. اما میزان بیان ژن NOS نورونی و اندوتلیالی در بافت دئودنوم کاهش و در بافت قولون افزایش داشته است. این مشاهدات حاکی است که علی‌رغم وجود کاهش در میزان بیان ژن NOS نورونی و اندوتلیالی، میزانNO آزاد شده در روده حیوانات دریافت کننده تریاک نسبت به گروه شاهد، تغییرات معنی‌داری را نشان نمی‌دهد، هرچند که میزان بیان ژن NOS نورونی و اندوتلیالی در دئودنوم و قولون از بیان ژن NOS القایی بیشتر بود.

مطالعات نشان می‌دهند که اوپیویید‌ها و نیتریک اکساید در تنظیم فعالیت‌های دستگاه گوارش با یکدیگر مرتبط هستند (28). نقش نیتریک اکساید به عنوان یک عامل کلیدی و مهم در مسیرهای پیام‌رسانی فعالیت‌های مختلف دستگاه گوارش از جمله شل شدگی و انبساط عضلات صاف، گزارش شده است (30). در مطالعه‌ای، Iwata و همکاران در سال 2007، گزارش کردند که مورفین از طریق گیرنده‌های اوپیوئیدی μ سبب انقباض عضله حلقوی ایلئوم در موش سوری می‌شود که این انقباض می‌تواند با آزاد شدن نیتریک اکساید از اعصاب سیستم غیرآدرنرژیک غیر‌کولینرژیک (نیتررژیک) ارتباط داشته باشد (15). لذا این احتمال وجود دارد که اثرات سوء ناشی از اوپیوئیدها می‌تواند به علت اختلال در تولید یا عملکرد نیتریک اکساید در بافت‌های لوله گوارش باشد (20). تحقیقات Calignano و همکاران در سال 1991 نشان داد که یبوست ناشی از اوپیوئیدها می‌تواند به علت اثرات انقباضی آن بر عضله حلقوی روده‌ها باشد (6). بدین لحاظ می‌توان گفت که اختلال ایجاد شده در حرکات گوارشی توسط اوپیوئیدها، ممکن است از طریق ایجاد اسپاسم تونیک در روده انسان یا سایر گونه‌های حیوانی باشد. بدین صورت که افزایش انقباضات روده ناشی از مواد مخدر ممکن است به دنبال کاهش آزاد‌سازی نیتریک اکساید از نورون‌های مهاری در دستگاه گوارش (5،16) و یا از طریق فعال‌سازی مستقیم گیرنده‌های اوپیوئیدی سلول‌های عضلانی باشد (25). در گزارش Ono و همکاران در سال 2014 آمده که مورفین با القای انقباض در لوله گوارش موش سوری، سبب یبوست می‌شود. آن‌ها در مطالعه بالینی خود دریافتند که رکتوم و قولون‌انتهایی به عنوان دو جایگاه‌ مؤثر‌ برای ایجاد یبوست، دارای بیشترین انقباض در مواجه با مورفین بود که با تجویز مهار کننده سنتز NO یعنی L-NAME، این انقباضی ناشی از مورفین تشدید شد. در حالیکه تجویز ال-‌آرژینین، سبب کاهش این انقباضات شد (23). در مطالعه مروری Shah و همکاران در سال 2004 آمده است که نیتریک اکساید و ال-آرژینین سبب کاهش حرکات و افزایش زمان تخلیه معده در شرایط فیزیولوژیک می‌شوند، ولی مهارکننده‌های NOS، سبب افزایش میزان تخلیه معده و افزایش فعالیت‌های حرکتی روده‌ها می‌شوند (27). اما Hellström  و  Ljungدر سال 1996 اعلام کردند که مهار سنتز نیتریک اکساید بوسیله L-NAME، منجر به اختلال حرکات روده کوچک و طولانی شدن انتقال مواد و یبوست می‌شود (12). در مطالعات دیگری نشان داده شده که تجویز مهار کننده نیتریک اکساید سنتاز (L-NAME) باعث تحریک فرکانس سیکل حرکتی در معده و روده‌ی خرگوش در محیط برون‌تنی شده است، همچنین تجویز داخل رگی این ماده، سبب افزایش انقباضات روده کوچک و کاهش حرکات روده در محیط درون‌تنی در سگ، رت، جوجه و گوسفند شده است (26).

شواهد حاکی است که مورفین موجب تغییرات رفتاری تغذیه‌ای از جمله افزایش تحرکات حیوان و اخذ غذا در موش سوری می‌شود. در حالی که مصرف ال-‌آرژینین باعث افزایش اثرات تحریک فعالیت ناشی از مورفین (افزایش تحرکات و اخذ غذا)  می‌شود، اما تجویز داروی L-NAME، این اثرات را کاهش می‌دهد (6). مطالعه Bhargava و همکاران در سال 1995 نشان داد که مصرف طولانی مورفین باعث افزایش فعالیت NOS نورونی در برخی از مناطق مغز می‌شود (2). درمان‌های کوتاه مدت با مورفین سبب افزایش NOS و کلسیم داخل سلولی در مخچه موش سوری شده است که با نالوکسان قابل برگشت می‌باشد (4). گیرنده اوپیوئیدی 3µ بین ترکیبات اوپیوئیدی و نیتریک اکساید ارتباط برقرار می‌کند. این گیرنده که در سلول‌های معده پستانداران گسترش فراوانی دارد برای آلکالوئیدهای اوپیوئیدی انتخابی عمل می‌کند و حساسیت زیادی نسبت به پپتیدهای مخدر ندارد (4،28). اوپیوئیدها با مهار کانال‌های کلسیم و متعاقب آن افزایش فعالیت آدنیلات سیکلاز، بر آزاد‌سازی نیتریک اکساید اثر گذار هستند (22).

نتایج مطالعه حاضر نشان داد که تریاک با تغییر در فعالیت دامنه و فرکانس انقباضات ماهیچه صاف روده، سبب افزایش انقباض عضله صاف و ایجاد اسپاسم عضلانی در روده‌های موش سوری می‌شود که میزان این تغییرات در قولون شدید‌تر از روده کوچک می‌باشد. بین انقباض عضله صاف و ایجاد اسپاسم عضلانی و میزان پیشروی ترکیب زغال+صمغ در روده موش‌های سوری درمان شده با تریاک، ارتباط مستقیمی وجود داشته است. به نظر می‌رسد افزایش تعداد انقباضات در واحد زمان، حرکات خودبه خودی عضلات صاف روده را به حالت شبه اسپاسم در می‌آورد و از روند طبیعی خود خارج می‌شود. این تغییر رفتار انقباضی روده‌ها، سبب کاهش میزان پیشروی ترکیب زغال+صمغ در دستگاه گوارش موش شده است. در همین راستا، نتایج نشان داد که میزان نیتریک اکساید آزاد شده در بافت دئودنوم بیشتر از بافت قولون بوده است که این می‌تواند به دلیل استقرار سلول‌های عصبی و شبکه عصبی میانتریک و اورباخ در بافت روده‌ی کوچک باشد. اما تغییرات دامنه و فرکانس در قولون بیشتر از روده کوچک بود که قوی‌تر بودن عضلات قولون و قدرت انقباضی بیشتر آن نسبت به روده کوچک، می‌تواند دلیلی بر این مشاهدات باشد. با وجود کاهش میزان بیان ژن NOS نورونی و اندوتلیالی در دئودنوم، میزان نیتریک اکساید آزاد شده در این قسمت از لوله گوارش حیوانات دریافت کننده تریاک، تغییرات معنی‌داری در مقایسه با گروه شاهد نشان داده نشد. اما چون بیان ژن NOS  القایی، نورونی و اندوتلیالی در قولون افزایش یافته بود، می‌توان نتیجه گرفت که تغییرات بیان ژن NOS می‌تواند یک سیستم جبرانی برای مقابله با اختلال ایجاد شده در فرآیند طبیعی حرکات گوارشی و اسپاسم عضلانی ناشی از تریاک باشد.

سپاسگزاری

نویسندگان مقاله بر خود لازم می‌دانند از همکاری و راهنمایی‌های دو تن از دانش آموختگان دوره دکتری تخصصی فارماکولوژی آقایان دکتر صمد محمد‌زاده و دکتر سید‌رضا هاشمی، تشکر و قدردانی نمایند. همچنین از آقای هاشم فرخ بال، تکنیسین و آقای غلامرضا شمس، کارشناس گروه علوم زیستی مقایسه‌ای به خاطر کمک‌‌هایشان در اجرای پروژه تحقیقاتی مرتبط با این مقاله، سپاسگزاری می‌شود.

تعارض منافع

بین نویسندگان مقاله حاضر، تعارض در منافع گزارش نشده است.

 

جدول 1. فعالیت مکانیکی بافت ایزوله با دو شاخص دامنه انقباضات بر حسب گرم  و فرکانس آن بر حسب هرتز در قطعات ایزوله دئودنوم، ژوژنوم، ایلئوم، قولون ابتدایی، میانی و انتهایی موش سوری از حیوانات تحت درمان با آب مقطر، تریاک، تریاک+ال‌-آرژینین، ال‌-آرژینین، تریاک+L-NAME و L-NAME. داده‌ها به صورت Mean±SD، بیان شده است و حروف الفبای غیرمشابه بین گروه‌های درمانی در ردیف های افقی، اختلاف معنی‌دار (05/0P<) را بین گروه‌ها نشان می‌دهد. تعداد نمونه در هرگروه‌ها برابر عدد 6 بوده است.

گروه‌های درمانی

آب مقطر

تریاک

تریاک+ال-آرژینین

ال- آرژینین

تریاک+ال-نیم

ال- نیم

دئودنوم

دامنه

ad6/20±1/83

b2/11±1/48

ac4/25±6/95

c9/17±7/116

bd9/17±4/58

b8/10±8/33

فرکانس

a1/61±3/533

b3/93±3/634

ab1/39±7/604

ab7/106±2/594

ab8/32±3/603

ab7/70±8/564

ژوژنوم

دامنه

a5/18±2/58

a1/9±9/52

ad2/15±1/67

cd8/7±2/27

ad6/7±3/59

b7/21±8/76

فرکانس

a8/79±6/598

ab9/26±2/537

ab5/62±8/497

ab3/100±536

b9/95±9/491

ab6/99±9/499

ایلئوم

دامنه

b7/18±8/75

a5/14±1/50

ab4/14±3/66

b30±2/90

ab12±9/56

a2/18±3/51

فرکانس

a8/99±1/548

a152±4/480

a91±4/476

a7/103±4/467

a1/78±6/513

a7/101±8/543

قولون ابتدایی

دامنه

ac3/67±3/325

ac4/68±9/334

ab153±8/412

b8/225±3/539

cd6/93±8/243

d5/52±2/183

فرکانس

ab9/69±2/201

a9/61±3/150

bc9/136±6/291

b2/82±9/341

ac1/61±3/194

b3/57±3/310

قولون میانی

دامنه

ac1/111±9/333

ac91±1/296

a6/156±9/361

b183±8/533

c5/58±6/203

d7/31±162

فرکانس

a2/66±9/196

b9/235±3/480

a9/40±3/152

d4/264±2/671

a6/76±7/284

a4/60±6/237

قولون انتهایی

دامنه

a4/66±4/290

a1/152±2/350

a9/124±1/389

a113±6/391

b63±9/142

ab3/97±7/253

فرکانس

ab5/35±9/196

ac2/77±6/272

b3/30±8/144

c8/108±8/274

b7/35±8/179

b9/31±173

 

نمودار 1. بیان ژن نیتریک اکساید سنتاز القایی (iNOS) در بافت‌های دئودنوم و قولون ابتدایی موش سوری در گروه‌های مختلف آزمایش را نشان می‌دهد، حروف الفبای غیر یکسان تفاوت معنی‌داری 05/0 P<را بین گروه‌ها نشان می‌دهد (تعداد نمونه در هر گروه 6 عدد است).

نمودار ‌2. بیان ژن نیتریک اکساید سنتاز نورونی (nNOS) در بافت‌های دئودنوم و قولون ابتدایی موش سوری در گروه‌های مختلف آزمایش را نشان می‌دهد، حروف الفبای غیر یکسان تفاوت معنی‌داری (05/0P<) را بین گروه‌ها نشان می‌دهد (تعداد نمونه در هر گروه 6 عدد است).

نمودار 3. بیان ژن نیتریک اکساید سنتاز اندوتلیالی (eNOS) در بافت‌های دئودنوم و قولون ابتدایی موش سوری در گروه‌های مختلف آزمایش را نشان می‌دهد، حروف الفبای غیر یکسان تفاوت معنی‌داری (05/0P<) را بین گروه‌ها نشان می‌دهد (تعداد نمونه در هر گروه 6 عدد است).

نمودار ‌4. میزان سطح نیتریت در بافت دئودنوم و قولون ابتدایی موش‌های سوری در گروه‌های مختلف آزمایش را نشان می‌دهد، حروف الفبای غیر یکسان تفاوت معنی‌داری (05/0P<) را بین گروه‌ها نشان می‌دهد (تعداد نمونه در هر گروه 6 عدد است).

نمودار‌5. درصد پیشروی زغال+صمغ در روده کوچک را بین گروه‌ها نشان می‌دهد. حروف الفبای غیر یکسان تفاوت معنی‌داری (05/0P<) را بین گروه‌ها نشان می‌دهد (تعداد نمونه در هر گروه 5 عدد است).

 

 

 

  1. Arab, H. A., Muhammadnejad, S., Faghihi, S. M., Hassanpour, H., Muhammadnejad, A. (2014). Effects of nitric oxide modulating activities on development of enteric nervous system mediated gut motility in chick embryo model. J Biosci, 39(5) ,835-848. https://doi.org/10.1007/s12038-014-9474-4 PMID: 25431412.
  2. Bhargava, H. N. (1995). Attenuation of tolerance to, and physical dependence on, morphine in the rat by inhibition of nitric oxide synthase. Gen Pharmacol, 26(5), 1049-1053. https://doi.org/10.1016/0306-3623(94)00271-N PMID: 7557 249.
  3. Brennan, M. J. (2013). The effect of opioid therapy on endocrine function. Am J Med, 126(3), S12-S18. https://doi. org/10.1016/j.amjmed.2012.12.001 PMID: 23414717.
  4. Cadet, P., Mantione, K. J., Zhu, W., Kream, R. M., Sheehan, M., Stefano, G. B. (2007). A functionally coupled μ3-like opiate receptor/nitric oxide regulatory pathway in human multi-lineage progenitor cells. J Immunol, 179(9), 5839-5844. https://doi.org/10.4049/jimmunol.179.9.5839.
  5. Calignano, A., Moncada, S., Di Rosa, M. (1991) Endogenous nitric oxide modulates morphine-induced constipation. Biochem Biophys Res Commun, 181(2), 889-893. https://doi. org/10.1016/0006-291x(91)91274-g PMID: 1755865.
  6. Calignano, A., Persico, P., Mancuso, F., Sorrentino, L. (1993). Endogenous nitric oxide modulates morphine-induced changes in locomotion and food intake in mice. Eur J Pharmacol, 231(3), 415-419. https://doi.org/10.1016/0014-2999(93)90118-2
  7. Camilleri, M., Drossman, D., Becker, G., Webster, L., Davies, A., Mawe, G. (2014). Emerging treatments in neurogastroenterology: A multidisciplinary working group consensus statement on opioid‐induced constipation. Neurogastroenterol Motil, 26(10), 1386-1395. https://doi. org/10.1111/nmo.12417. PMID: 25164154
  8. Chen, W., Chung, H.-H., Cheng, J.-T. (2012). Opiate-induced constipation related to activation of small intestine opioid μ2-receptors. World J Gastroenterol, 18(12), 1391. https://doi. org/ 10.3748/wjg.v18.i12.1391 PMID: 22493554
  9. Coyne, K. S., LoCasale, R. J., Datto, C. J., Sexton, C. C., Yeomans, K., Tack, J. (2014). Opioid-induced constipation in patients with chronic noncancer pain in the USA, Canada, Germany, and the UK: descriptive analysis of baseline patient-reported outcomes and retrospective chart review. Clinicoecon Outcomes Res, 6, 269. https://doi.org/10.2147/ CEOR.S61602  PMID: 24904217
  10. Farzi, A., Halicka, J., Mayerhofer, R., Fröhlich, E. E., Tatzl, E., Holzer, P. (2015). Toll-like receptor 4 contributes to the inhibitory effect of morphine on colonic motility in vitro and in vivo. Sci Rep, 5, 9499. https://doi.org/10.1038/srep09499, PMID: 25962524.
  11. Hassanpour, H., Nikoukar, Z., Nasiri, L., Bahadoran, S. (2015). Differential gene expression of three nitric oxide synthases is consistent with increased nitric oxide in the hindbrain of broilers with cold-induced pulmonary hypertension. Br Poult Sci, 56(4), 436-442. https://doi.org/10. 1080/00071668.2015.1058920 PMID: 26053227
  12. Hellström, P., Ljung, T. (1996). Nitrergic inhibition of migrating myoelectric complex in the rat is mediated by vasoactive intestinal peptide. J Neurogastroenterol Motil, 8(4), 299-306. https://doi.org/10.1111/j.1365-2982.1996. tb00268.x
  13. Holzer, P. (2014). Pharmacology of opioids and their effects on gastrointestinal function. Am J Gastroenterol, 2(1), 9. https://doi.org/10.1038/ajgsup.2014.4
  14. Hooten, W. M., Lamer, T. J., Twyner, C. (2015). Opioid-induced hyperalgesia in community-dwelling adults with chronic pain. Pain, 156(6), 1145. https://doi.org/10.1097/ j.pain.0000000000000170, PMID: 25815431
  15. Iwata, H., Tsuchiya, S., Nakamura, T., Yano, S. (2007). Morphine leads to contraction of the ileal circular muscle via inhibition of the nitrergic pathway in mice. Eur J pharmacol, 574(1), 66-70. https://doi.org/10.1016/j.ejphar.2007.06.029
  16. Lénárd Jr, L., Halmai, V., Barthó, L. (1999). Morphine contracts the guinea pig ileal circular muscle by interfering with a nitric oxide mediated tonic inhibition. Digestion, 60(6), 562-566. https://doi.org/10.1159/000007707 PMID: 10545727
  17. Lowenstein, C. J., Dinerman, J. L., Snyder, S. H. (1994). Nitric oxide: a physiologic messenger.Ann Intern Med, 120(3), 227-23. PMID: 8273987
  18. Majeed, N., Przewłocka, B., Machelska, H., Przewłocki, R. (1994). Inhibition of nitric oxide synthase attenuates the development of morphine tolerance and dependence in mice. Neuropharmacology, 33(2), 189-192. https://doi.org/10. 1016/0028-3908(94)90006 PMID: 7518573
  19. Mashimo, H., Goyal, R. (1999). Lessons from genetically engineered animal models. IV. Nitric oxide synthase gene knockout mice. Am J Physiol, 277 (3), 745-750. https:// doi.org/10.1152/ajpgi.1999.277.4.G745 PMID: 10516139
  20. Namiranian, K., Samini, M., Mehr, S. E., Gaskari, S. A., Rastegar, H., Homayoun, H., Dehpour, A. R. (2001). Mesenteric vascular bed responsiveness in bile duct-ligated rats: roles of opioid and nitric oxide systems. EurJ pharmacol, 423(2-3), 185-193. https://doi.org/10.1016/s0014-2999(01) 01091-3 PMID: 11448484
  21. Nelson, A. D., Camilleri, M. (2016). Opioid-induced constipation: advances and clinical guidance. Ther Adv Chronic Dis, 7(2), 121-134. https://doi.org/10.1177/ 2040622315627801 PMID: 26977281
  22.  Nieto-Fernandez, F. E., Mattocks, D., Cavani, F., Salzet, M., Stefano, G. B. (1999). Morphine coupling to invertebrate immunocyte nitric oxide release is dependent on intracellular calcium transients.Comp Biochem Physiol B., 123(3), 295-299. https://doi.org/10.1016/S0305-0491(99)00074-7 PMID: 10481258
  23. Ono, H., Nakamura, A., Matsumoto, K., Horie, S., Sakaguchi, G., Kanemasa, T. (2014). Circular muscle contraction in the mice rectum plays a key role in morphine‐induced constipation. Neurogastroenterol Motil, 26(10), 1396-1407. https://doi.org/10.1111/nmo.12443 PMID: 25257923
  24. Osinski, M. A., Brown, D. R. (2000). Orphanin FQ/nociceptin: a novel neuromodulator of gastrointestinal function, Peptides, 21(7), 999-1005. https://doi.org/10.1016/ S0196-9781(00)00240-0 PMID:10998534.
  25. Poonyachoti, S., Portoghese, P. S., Brown, D. R. (2001). Characterization of opioid receptors modulating neurogenic contractions of circular muscle from porcine ileum and evidence that δ-and κ-opioid receptors are coexpressed in myenteric neurons. J Pharmacol Exp Ther, 297(1), 69-77. PMID: 11259529
  26. Romanski, K. W. (2009). Mechanisms controlling the gastrointestinal migrating motor complex. J Pre Clin Clin Res, 3(1), 11-19. https://doi.org/10.5056/jnm.2012.18.3.246 PMID: 22837872
  27. Shah, V., Lyford, G., Gores, G., Farrugia, G. (2004). Nitric oxide in gastrointestinal health and disease. Gastroenterology, 126(3), 903-913. https://doi.org/10.1053/j. gastro.2003.11.046 PMID: 14988844
  28. Stefano, G., Zhu, W., Cadet, P., Bilfinger, T., Mantione, K. (2004). Morphine enhances nitric oxide release. J Physiol Pharmacol, 55(1), 279-288. PMID: 15082884
  29. Tack, J., Corsetti, M. (2014). Naloxegol for the treatment of opioid-induced constipation. Expert Rev Gastroenterol Hepatol, 8(8), 855-861. https://doi.org/10.1586/17474124. 2014.939629 PMID: 25220391
  30. Takahashi, T. (2003). Pathophysiological significance of neuronal nitric oxide synthase in the gastrointestinal tract.J Gastroenterol, 38(5), 421-430. https://doi.org/10.1007/ s00535-003-1094, PMID: 12768383