نوع مقاله : آسیب شناسی تشریحی و بالینی
نویسندگان
1 دانش آموخته واحد علوم و تحقیقات، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران
2 گروه پاتوبیولوژی، واحد علوم و تحقیقات، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران
چکیده
کلیدواژه‌ها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
BACKGROUND: Cadmium is a heavy metal harmful to animals and humans. Exposure to it causes inflammation, apoptosis, or necrosis in numerous tissues, including the adrenal.
OBJECTIVES: The present research investigates the effect of cadmium toxicity on the expression of genes involved in inflammation and fibrosis. Inflammation increases the rate of parenchymal cell death, and fibrosis will only fill the place of dead cells without being able to perform the function of the primary parenchyma.
METHODS: In this research, cadmium chloride with a concentration of 20 mg/kg was added to the diet of ten mice in two groups of five. On the 30th day of the study, the adrenal glands were quickly sent to the laboratory. The expression of NF-kB/MAPK, hematoxylin, eosin tissue staining, and immunohistochemistry (CD163) were performed.
RESULTS: The inflammation mentioned in others’ research can also be associated with the activation of the nuclear factor kappa (NF-kB) pathway. NF-κB gene products initiate mitogen-activated protein kinase (MAPK) and p38 pathways. Previous studies indicate that MAPK induces necrosis or apoptosis in tissues. In histopathology, dense and possibly pyknosis nuclei are more common in the cadmium group. The higher expression of the CD163 molecule in the cadmium group reveals the beginning of the fibrosis process after chronic inflammation.
CONCLUSIONS: This report provides more basic data to investigate the mechanism of adrenal damage in cadmium poisoning. Cadmium causes the death of cells by affecting the inflammatory pathways. Additionally, the stimulation of the fibrosis process causes greater irreparable damage to the damaged tissue of the adrenal gland.
کلیدواژه‌ها [English]
کادمیوم فلزی سنگین است که در لحیم و باتری به کار برده می‌شود و به عنوان آلیاژ در آبکاری و پوشش‌های فلزی کاربرد دارد. راه‌های ورود کلرید کادمیوم (CdCl2) به بدن انسان و حیوانات بیشتر از طریق استنشاق و دستگاه گوارش می‌باشد. قرار گرفتن مکرر و طولانی مدت در معرض این فلز باعث ایجاد اثرات سمی متعدد از جمله بیماری‌های ریوی، کبدی، کلیوی و قلبی-عروقی می‌شود. اندام‌های هدف کادمیوم بیضه‌ها، کبد، کلیه‌ها و حتی ادرنال است. اندام‌های غدد درون ریز هنگام مواجهه با کادمیوم آسیب می‌بینند (1). کادمیوم می‌تواند باعث التهاب لوزالمعده موش صحرایی شود. در واقع کادمیوم در پانکراس موش‌ها انباشته شده و از طریق بیان بیش از حد نیتریک اکسید سنتاز (iNOS)، فاکتور هسته‌ای-ĸB (NF-κB)، اینترلوکین-6 (IL-6) و فاکتور نکروز تومور آلفا (TNF-α)، همراه با تغییرات هیستوپاتولوژی التهاب پانکراس را تحریک می‌کند (2).Monaco و همکاران در سال 2017 مشاهده کردند که کاهش قابل توجه سطح هورمون‌های تیروئید و کاهش بیان ژن‌های دخیل در محور هیپوتالاموس-هیپوفیز- تیروئید در دو نسل لارو گورخرماهی (Danio rerio) با قرار‌گرفتن والدین با کادمیوم همراه با تریبوتیلتین (که یک ضدحیات است معمولاً به عنوان رنگ روی بدنه کشتی‌های اقیانوس پیما به‌کار می‌رود تا جلبک‌ها رشد نکنند tributyltin) اتفاق افتاده است (3). افزودن طولانی مدت کادمیوم به جیره غذایی موش‌ها موجب تجمع آن به صورت مزمن و گسترده در کلیه‌ها شده است. اختلال در عملکرد کلیه زمانی رخ می‌دهد که میزان محتوای کادمیوم در قشر کلیه به آستانه بحرانی 200 میلی‌گرم بر کیلوگرم برسد (4). Imam و همکاران در سال 2020 نشان دادند که کادمیوم موجب خودخوری سلولی در قشر غده فوق کلیه می‌شود. طولانی و مزمن شدن نارسایی کلیه موجب استئومالاسیا (Osteomalacia) خواهد شد. دفع کادمیوم عمدتاً توسط کلیه‌ها صورت می‌گیرد اما این روند بسیار کند و ناکافی است، از طرفی این فلز نیمه عمر طولانی دارد، پس با این حساب اثرات مخرب زیادی دارد (5). Pearson و همکاران در سال 2001 نشان دادند که کینازی به نام MAPK در مسیرهای انتقال سیگنال مشارکت دارد که رویدادهای درون سلولی از جمله پاسخ‌های هورمونی و رشد در موجودات ارگانیسمی مختلف را کنترل می‌کند (6).Tak و همکاران در سال 2001 ثابت کردند که فاکتور هسته‌ای تقویت کننده زنجیره سبک کاپا NF-κB، در لنفوسیت‌های B فعال شده در حال رونویسی DNA دیده می‌شود. این فاکتور تقریباً در تمام سلول‌ها و گونه‌های پستانداران یافت می‌شود و نقش کلیدی در تنظیم پاسخ ایمنی دارد. تنظیم نادرست آن با سرطان و بیماری‌های خود ایمنی مرتبط است (7). در مطالعه حاضر تأثیر کادمیوم روی بیان ژن‌های MAPK و NF-κB در غده فوق کلیه موش بررسی شد. Antar و همکاران در سال 2022 در یک مطالعه نشان دادند که کلرید کادمیوم می‌تواند گلوتاتیون، کاتالاز و سوپراکسید دیسموتاز را در بیضه‌ها کاهش دهد و هم‌زمان موجب افزایش بروز TNFα و فاکتور هسته‌ای کاپای B (NF-κB) شود. TNFα عامل اصلی ایجاد رادیکال‌های اکسیداتیو، التهاب، بروز ژن‌های Beclin-1، LC3B و کاسپاز-3 هم‌زمان با تغییرات هیستوپاتولوژی است. پروتئین‌های Beclin-1 و LC3B مسئول خودخوری سلولی و کاسپاز-3 مسئول آپوپتوز میباشند. درمان با ملاتونین می‌تواند اثرات سمی ناشی از کادمیوم را در بیضه کاهش دهد (8). در آپوپتوز ناشی از استرس اکسیداتیو، وجود MAPK برای سیگنال دهی آپوپتوز لازم است. فعالیت آن بیان ژن و مسیرهای آپوپتوز را تحت کنترل دارد. خانواده MAPK از سه پروتئین کیناز اصلی به نام‌های ERK، JNK و p38 تشکیل شده است که ارتباط نزدیکی با رشد و تمایز سلولی دارند. این پروتئین‌ها مرتبط با التهاب، آپوپتوز و مرگ سلولی میباشند. مسیر ERK نقش اساسی در انتقال سیگنال‌های میتوژن‌ها مانند فاکتور رشد اپیدرمی (EGF) دارد که باعث رشد و تکثیر سلولی می‌شود. JNK از طریق یک سری مواد واسطه، p53 را فعال می‌کند و آن نیز پروتئین Bax را فعال می‌کند که شروع آپوپتوز است. قوی‌ترین فعال کننده ژن p38 استرس اکسیداتیو است. P38 می‌تواند باعث فعالیت زیاد فاکتور رونویسی NF-kB شود. این فاکتور رونویسی معمولاً سیستم ایمنی و التهاب را تحریک می‌کند (9). Tian و همکاران در سال 2020 بیان داشتند که گورخرماهی‌های بالغ که در معرض 1 میکرومول در لیتر کلرید کادمیوم قرار داشتند، فرزندانی با درجات مختلف ناهنجاری تولید کردند. به‌عنوان نمونه سطح تری یدوتیرونین و تیروکسین در بالغین و نیز لاروها کاهش یافته بود (10). Yang و همکاران در سال 2021 گزارش کردند که کادمیوم باعث فعال شدن مسیر پروتئین کینازهای تنظیم شده خارج سلولی (ERK) در غده تیروئید موش و آسیب غده تیروئید می‌شود (11). تجمع کادمیوم در پانکراس موش‌ها می‌تواند باعث فعال‌سازی فاکتورهای التهابی iNO، TNFα و IL6 در خارج سلول و NF-kB در داخل هسته لکوسیت‌ها و در نتیجه ضایعات پانکراس در رت‌ها شود(12).Leal و همکاران در سال 2007 اثبات کردند که کادمیوم باعث تحریک MAPKها و فسفوریلاسیون Hsp27 در سلول‌های کرومافین آدرنال گاو می‌شود. بنابراین، سلول‌های کرومافین آدرنال یک هدف برای کادمیوم میباشند. و هر دو ERK1/2 و p38 فعال می‌شوند. علاوه بر این، Hsp27 در پاسخ به فعال شدن p38، بسیار فسفریله می‌شود. این اثرات بیوشیمیایی کادمیوم ممکن است عملکرد ترشحی طبیعی این سلول‌ها را مختل کند (13). به طور مشابه، قرار گرفتن در معرض کادمیوم در بافت مغز جوجه‌ها باعث افزایش سطح بیان ژن‌های RIPK1، RIPK3 و MLKL و کاهش سطح کاسپاز 8 می‌شود. در نتیجه کادمیوم در جوجه‌ها بیش از آپوپتوز باعث ایجاد نکروپتوز (Necroptosis) می‌شود (14). در مطالعه حاضر برای مشخص شدن تأثیرات کادمیوم روی غده فوق کلیوی موش‌ها از سنجش بیان ژن‌های مربوط به التهاب استفاده شد.
مدل‌ها و گروه‌های حیوانات: ده سر موش نژاد بالب سی نر با وزن 20 گرم به عنوان حیوانات آزمایشی مورد استفاده قرار گرفتند. قوانین اخلاقی دانشگاه مربوط به نحوه نگهداری حیوانات آزمایشگاهی رعایت شد. موش‌ها به‌طور تصادفی به دو گروه پنج سری کادمیوم و کنترل تقسیم شدند. موش‌ها در دمای کنترل شده 2±25 درجه سانتی‌گراد و رطوبت 15±50 درصد و دوره نوری نرمال (12 ساعت شب و 12 ساعت روز) نگهداری شدند. گروه کادمیوم با یک رژیم غذایی پایه مکمل همراه با تزریق زیر پوستی 1 میلی‌گرم بر کیلوگرم کلرید کادمیوم در هر روز به مدت چهار هفته نگهداری شدند (15) و گروه کنترل با یک رژیم غذایی پایه تغذیه شدند. در طول فرایند تغذیه، غذا و آب آزادانه در اختیار حیوانات بود. موش‌ها بعد از چهار هفته از شروع آزمایش با فنوباربیتال 150 میلی‌گرم بر کیلوگرم به صورت داخل صفاقی مهرین کشی (euthanasia) شدند. سپس بافت غده آدرنال موش‌ها به سرعت جمع‌آوری و در نیتروژن مایع ذخیره شد.
واکنش زنجیره‌ای پلیمراز کمی در زمان واقعی (qRT-PCR): برای این کار، RNA کل از بافت غده آدرنال استخراج شد و سپس به cDNA رونویسی شد. توالی پرایمرها در جدول 1 نشان داده شده است. مجموع واکنش حدود 10 میکرولیتر به‌صورت دو محلول سایبرگرین میکس (SYBR Green mix ) هرکدام 5 میکرولیتر، یک میکرولیترcDNA ، 3/0 میکرولیتر پرایمر فوروارد، 3/0 میکرولیتر پرایمر معکوس و 4/3 میکرولیتر آب دوبار تقطیر‌شده (ddH2O) بدونRNAse صورت گرفت. در ادامه از دستگاه LightCycler®480 (BIOER، چین) استفاده شد. بتا اکتین به عنوان یک ژن مرجع برای سایر ژن‌ها استفاده شد. نتیجه نهایی با روش2-△△Ct پردازش گردید (16).
بررسی هیستوپاتولوژیک (H&E): در روز پایانی مطالعه بافت‌های غدد فوق کلیوی به سرعت در فرمالدئید 10 درصد حداقل به مدت 24 ساعت ثابت شدند و در بلوک‌های پارافینی تهیه شده، مقاطع (ضخامت 5 میکرومتر) برش داده شده، به دست آمد و با هماتوکسیلین و ائوزین (H&E) برای مشاهده میکروسکوپی رنگ‌آمیزی شد و از آنتی بادی ضد CD163 (خرگوشی ضد انسانی شرکت سما تشخیص، کد EP324) برای ایمونوهیستوشیمی استفاده شد.
بررسی آماری: داده‌ها به‌وسیله نرم افزار گراف‌پد‌پریسم 9 با آزمون واریانس یک طرفه و تست توکی (Tukey) انجام شد. نمودارها نیز توسط همین نرم افزار (GraphPad Prism version 9.0) ترسیم شد.
فعال شدن مسیرهای NF-kB و MAPK پس از مواجهه با کادمیوم: ضمن یادآوری این‌که مشخصه فعال‌شدن MAPK فعال‌شدن مولکول P38 است، به منظور اثبات این‌که آیا مسیرهای NF-κB و P38 نقش تنظیمی در بافت آدرنال موش‌های گروه کادمیوم ایفا می‌کنند، سطوح بیان ژن‌های مرتبط با مسیر سیگنالینگ NF-kB و P38 بررسی شد. در مقایسه با گروه کنترل، سطح بیان NF-κB و P38 در گروه کادمیوم به‌طور قابل‌توجهی به‌ترتیب 3/3 و 8/1 برابر افزایش یافت (05/0P<). نتایج نشان داد که مسیرهای P38 از مسیر MAPK و NF-kB در بافت آدرنال موش‌های آلوده به کادمیوم فعال می‌شوند.
تغییرات پاتولوژیک: مشخص شد که ماکروفاژهای CD163 مثبت سایتوکاین‌های فیبروز‌دهنده بیشتری ترشح می‌کنند. بافت غده آدرنال گروه کنترل در تصویر 1 AوB نشان داده شد. غدد فوق کلیوی در گروه کنترل گرد و پر از آسینوس بودند. غدد آدرنال در گروه کادمیوم دچار آتروفی آسینار و پیکنوز بودند. اکثر آسینارها پس از آتروفی فاقد شکل گرد بودند. مشاهدات ایمونوهیستوشیمی با بیشتر بودن ماکروفاژهای CD163 مثبت درون سینوزوئیدها بیانگر فیبروز ناشی از تأثیرات مهلک کادمیوم در غده فوق کلیوی بود (تصویر 2 A وB ).
گزارش‌های بسیاری بیان کرده‌اند که کادمیوم می‌تواند باعث التهاب و نکروپتوز (حالتی بین نکروز و آپوپتوز) در بافت‌های مختلف شود. Hesaraki و همکاران در سال 2010 نشان دادند که تحت شرایط تجربی غلظت‌های بالای کادمیوم در جیره (ppm 100 و 50) اثرات نکروز دهنده، آپوپتوز‌دهنده و دژنره‌کننده در کلیه‌ها و کبد جوجه‌های گوشتی 8 هفته دارد (19). Gharagozlou و همکاران در سال 2011 نشان دادند که غلظت‌های بالای کادمیوم در جیره (ppm 100 و 50) اثرات آپوپتوز‌دهنده و دژنره‌کننده در بورس‌فابریسیوس جوجه‌های گوشتی 8 هفته دارد (20). Xin و همکاران در سال 2020 نتیجه گرفتند که قرار گرفتن در معرض کادمیوم مسیر سیگنالینگ ALK4/5 را برای القای نکروپتوز در سلول‌های اپیتلیال لوله کلیوی فعال کرد. علاوه بر این، قرار گرفتن در معرض کادمیوم همچنین باعث فعال شدن مسیر سیگنالینگ PI3K/AKT در لنفوسیت‌های خون محیطی مرغ می‌شود که منجر به نکروپتوز خواهد شد (21). نتایج مطالعه حاضر تأیید کرد که قرار گرفتن در معرض کادمیوم مسیر NF-kB را فعال و باعث افزایش بیان عوامل التهابی شد. علاوه بر این، قرار گرفتن در معرض کادمیوم باعث فعال شدن مسیر MAPK شد که با افزایش بیان P38 نیز مشخص و منجر به نکروپتوز آدرنال شد. تغییرات زیادی مانند یوبیکوئیتین در فرآیند ترجمه پروتئین وجود داشت که منجر به تخریب جزئی پروتئین شد. بنابراین بیان mRNA با بیان پروتئین متناسب نیست. Lv و همکاران در سال 2021 بیان‌کردند که التهاب و نکروپتوز به‌طور جدایی ناپذیری مرتبط میباشند. گزارش شده است که در مطالعه استئاتوهپاتیت غیر‌الکلی (NASH)، فرآیند التهاب در کبد باعث بروز نکروپتوز کبدی می‌شود و دلیل آن افزایش بیان گیرنده شماره یک TNF بود (22). Nicolè و همکاران در سال 2021 نشان دادند که مسیر NF-kB اغلب به عنوان یک مسیر التهابی کلاسیک شناخته می‌شود و توانایی القای نکروپتوز را دارد. مسیر انتقال سیگنال پیش التهابی NF-kB منجر به فعال‌سازی RIPK1/RIPK3 شده و تحریک نکروپتوز سلولی را تحریک می‌نماید (23).Zhang و همکاران در سال 2021 گزارش کردند که آلودگی لنفوسیت‌های مرغ با سرب باعث می‌شود سلول‌ها از طریق مسیر MAPK/NF-kB دچار نکروپتوز شوند (24). نتایج مطالعه حاضر نشان داد که افزایش بیان NF-kB در گروه کادمیوم در روند ایجاد نکروپتوز نقش دارند. Ramesh و همکاران در سال 2001 نشان دادند که قرار گرفتن در معرض سرب، ژن‌های مسیر MAPK/NF-kB (ERK، JNK، P38، NF-kB و TNF-α) را برای ایجاد نکروپتوز تحریک می‌کند (25). Liu و همکاران در سال 2022 گزارش کردند که آلودگی جگر مرغ با کادمیوم موجب بیان بیشتر ژن‌های MLKL، RIPK1، RIPK3، ERK، JNK و P38 و در نتیجه ایجاد نکروپتوز شده است (26). در نتایج تجربی مطالعه حاضر روی کادمیوم بیان پروتئین‌های P38 به طور قابل توجهی در غدد فوق کلیوی افزایش یافت، که نشان داد مسیر سیگنالینگ MAPK فعال شده بود. سطوح چندین سایتوکاین و کموکاین در بیماری‌های مختلف کبدی، به ویژه در نارسایی شدید کبدی افزایش می‌یابد. ماکروفاژهای فعال ممکن است در تولید این تعدیل کننده‌های ایمنی نقش داشته باشند. CD163 عضوی از خانواده گیرنده‌ها است و عمدتاً روی ماکروفاژهای فعال بیان می‌شود و یک فرم محلول (sCD163) نیز دارد که از ماکروفاژهای فعال آزاد می‌شود. Hiraoka و همکاران در سال 2005 و Kazankov و همکاران در سال 2022 مشخص کردند که سطح sCD163 در سرم بیماران مبتلا به نارسایی شدید کبدی، هپاتیت حاد با استفاده از روش الایزا اندازه‌گیری شد و بالاتر از افراد طبیعی بود. سطوح sCD163 در سرم بیماران مبتلا به نارسایی شدید کبدی از همه بالاتر بود. همچنین همبستگی خوبی بین سطوح سرمی sCD163 و زمان پروترومبین وجود داشت (677/0r = -؛ 0001/0P<). این مطالعه گذشته نشان داد که محصولات ماکروفاژهای فعال ممکن است در پاتوژنز نارسایی شدید کبدی نقش داشته باشند و نقش sCD163 ممکن است دارای اهمیت پیش آگهی در فیبروزی باشد که در نارسایی شدید کبدی شاهد هستیم (27). نتیجه مطالعه حاضر با یافته‌های بسیاری از نکروپتوزهای مشاهده شده در نتایج رنگ‌آمیزی H&E مطابقت داشت.
نتیجهگیری نهایی: نتایج مطالعه حاضر نشان داد که کادمیوم با فعال کردن مسیرهای NF-kB و MAPK و ضایعات پاتولوژیک باعث نکروپتوز در غده فوق کلیوی می‌شود. این یافته‌ها مبنایی نظری برای مطالعه بر روی مکانیسم مسمومیت با کادمیوم فراهم می‌کند که بیانگر التهاب و نکروپتوز در بافت غده آدرنال است.
مطالعه حاضر در مورد ارتباط مسمومیت به‌وسیله کادمیوم با بیان ژن‌های NF-kB/MAPK و CD163 در غده فوق‌کلیوی موش توسط واحد علوم و تحقیقات، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران حمایت شده است. از مهندس محمد عابدی (کارشناس آزمایشگاه دانشکده دامپزشکی) برای تهیه برش‌ها و رنگ آمیزی بافتی قدردانی می‌شود.
بین نویسندگان تعارض در منافع گزارش نشده است.
', './data/jvr/coversheet/cover_fa.jpg'))