ارزیابی تکنیک PCR-RFLP در شناسایی تنوع ژنتیکی کلستریدیوم پرفرنجنس بیوتایپA

نوع مقاله : میکروبشناسی و ایمنی شناسی

نویسندگان

1 دانش آموخته واحد کرمان، دانشگاه آزاد اسلامی، کرمان، ایران

2 بخش تحقیق و تولید فرآورده‎های بیولوژیک، شعبه کرمان، موسسه تحقیقات واکسن و سرم‌سازی رازی، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، کرمان، ایران

3 گروه میکروبیولوژی، واحد کرمان، دانشگاه آزاد اسلامی، کرمان، ایران

4 بخش تحقیق و توسعه، شعبه کرمان، موسسه تحقیقات واکسن و سرم‌سازی رازی، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، کرمان، ایران

چکیده

زمینۀ مطالعه: کلستریدیوم پرفرنجنس باسیل گرم مثبت بی‌هوازی و دارای اسپور است که بیوتایپ A آن مسئول انواع بیماری‌ها از جمله التهاب روده، اسهال خونی و قانقاریای گازی و یکی از عوامل اصلی سندرم خونریزی دهنده روده گاوها می‌باشد. تنوع ژنتیکی می‌تواند بیشترین تنوع فنوتیپی، توزیع جغرافیایی، ویژگی میزبانی، بیماریزایی، مقاومت آنتی بیوتیکی و حدت را در باکتری‌ها توضیح دهد. روش مولکولی مبتنی بر الگوی باندهایDNA ، باکتری را بر اساس اندازه قطعات تولید شده توسط هضم آنزیمی ژنوم طبقه بندی می‌کند.
هدف: استاندارد سازی و کاربرد تکنیک PCR-RFLP در شناسایی تنوع ژنتیکی جدایه‌های کلستریدیوم پرفرنجنس بیوتایپ A.
روش‎کار: استخراج DNA ژنومی سویه‌ها و سنتز توالی کامل لوکوس ژنی توکسین آلفا با استفاده از پرایمرهای اختصاصی طراحی شده با تکنیک PCR انجام شد. برش آنزیمی آمپلیکون‌های سنتز شده با آنزیم محدودالاثر Mse1 انجام و قطعات حاصل با تکنیک الکتروفورز از یکدیگر تفکیک شدند و توسط نرم افزار‌های ImageJ وNTSYSPC  مورد بررسی قرار گرفتند.
نتایج: یافته‌های به دست آمده نشان داد که توالی لوکوس ژنی توکسین آلفا ممکن است تغییرکند و حفاظت شده نباشد. در مطالعه حاضر چهار الگوی مختلف بر مبنای برش آنزیمی شناسایی شد. جهش در این لوکوس می‌تواند منجر به ایجاد تنوع در کلستریدیوم پرفرنجنس بیوتایپ A و ایجاد سویه‌های جدید شود.
نتیجه­گیری نهایی: لوکوس ژنی توکسین آلفا می‌تواند یک نشانگر مولکولیDNA  در کلستریدیوم پرفرنجنس محسوب شود و تکنیک PCR-RFLP به عنوان ابزاری برای تایپینگ این باکتری و تخمین میزان روابط فیلوژنتیکی از طریق مطالعات مقایسه‌ای توالی‌های نوکلئوتیدی کاربرد داشته باشد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Evaluating PCR-RFLP Technique in Identifying Genetic Diversity Clostridium perfringens Biotype A

نویسندگان [English]

  • Hamid Mosahasankhani 1
  • Mehrdad Shamsaddini Bafti 2
  • Nadia Kazemipour 3
  • Mojtaba Alimolaei 4
  • Farokh Rokhbakhsh-Zamin 3
1 Graduated from the Kerman Branch, Islamic Azad University, Kerman, Iran
2 Department of Research and Production of Biological Products, Kerman Branch, Razi Vaccine & Serum Research Institute, Agricultural Research, Education and Extension Organization (AREEO), Kerman, Iran
3 Department of Microbiology, Kerman Branch, Islamic Azad University, Kerman, Iran
4 Department of Research and Development, Kerman Branch, Razi Vaccine & Serum Research Institute, Agricultural Research, Education and Extension Organization (AREEO), Kerman, Iran
چکیده [English]

BACKGROUND: Clostridium perfringens (C. perfringens) is an anaerobic Gram-positive bacillus with spores, whose biotype A is responsible for a variety of diseases, including intestinal inflammation, bloody diarrhea, and gas gangrene, and hemorrhagic bowel syndrome. Genetic variety can explain the bacteria’s phenotypic diversity, geographic distribution, host specificity, pathogenicity, antibiotic resistance, and virulence. A molecular method using the pattern of DNA bands classifies bacteria based on the size of fragments produced by enzymatic digestion of the genome.
OBJECTIVES: This study aims to standardize the polymerase chain reaction (PCR)- restriction fragment length polymorphism (RFLP) method in identifying the genetic diversity of C. perfringens biotype A isolates.
METHODS: The genomic DNA of the investigated strains was extracted, and the complete sequence of the alpha toxin gene locus was synthesized using specific primers designed by PCR technique. Enzymatic cleavage of the synthesized amplicons was performed with the Mse l restriction enzyme, and the resulting fragments were separated by electrophoresis and analyzed by ImageJ and NTSYSPC software.
RESULTS: The findings showed that the alpha toxin gene locus sequence may change and is not conserved. In this research, 4 different patterns were identified based on enzymatic cleavage. Mutations in this locus can lead to diversity in C. perfringens biotype A and the creation of new strains.
CONCLUSIONS: The results of this research showed that the alpha toxin gene locus could be considered a DNA molecular marker in C. perfringens, and the PCR-RFLP technique can be used as a tool for typing this bacterium and estimating the phylogenetic relationships through comparative studies of nucleotide sequences.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Alpha Toxin
  • Clostridium perfringens
  • Genome
  • Hemorrhagic Bowel Syndrome
  • Typing

اصل مقاله

مقدمه

جنس کلستریدیوم از یک مجموعه ناهمگن بزرگ از باکتری‌های میله‌ای بی‌هوازی سازنده هاگ تشکیل شده است. اگرچه بخشی از فلور طبیعی دستگاه گوارش می‌باشند ولی عامل بیماریزای فرصت طلب بوده که در محیط، خاک، آب، فاضلاب و دستگاه گوارش حیوانات و انسان یافت می‌شوند (1). کلستریدیوم پرفرنجنس باعث ایجاد بیماری‌های زیادی در انسان و دام می‌شود. نوع توکسین‌های مترشحه، اساس طبقه‌بندی این باکتری می‌باشد. کلستریدیوم پرفرنجنس بیوتایپ A مسئول انواع بیماری‌ها از جمله عفونت‌های بافت نرم، مسمومیت غذایی، التهاب روده، اسهال خونی و قانقاریای گازی است (2، 3). توکسین آلفا توسط تیپ‌های مختلف باکتری کلستریدیوم پرفرنجنس تولید می‌شود و یک لسیتیناز (فسفولیپازC ) است که گویچه‌های قرمز و سفید، پلاکت‌ها و سلول‌های اندوتلیال را لیز می‌کند. توکسین آلفا یکی از چهار توکسین اصلی مترشحه از کلستریدیوم پرفرنجنس است که در همه تیپ‌ها وجود دارد و توسط لوکوس ژنی نزدیک نواحی متغیر در داخل کروموزوم بیان می‌شود (4). توکسین آلفا با استفاده از یک پپتید سیگنال (28 اسید آمینه اول) ترشح می‌شود و نتیجه آن ایجاد یک پروتئین بالغ متشکل از 370 آمینو اسید (43 کیلو دالتون) است. توکسین آلفا از دو بخش تشکیل شده است: یک دامنه از مارپیچ آلفا بنام انتهای  N(اسید آمینه‌های 246-1) و یک ساندویچ بتا بنام دامنه انتهای C (اسید آمینه‌های 370-256)، که توسط یک ناحیه اتصال دهنده کوتاه قابل انعطاف (اسید آمینه‌های 255-247) به یکدیگر وصل می‌شوند (5). Shoukat و همکاران در سال 2018 ژن‌های حدت کلستریدیوم پرفرنجنس را شناسایی کردند و شیوع آن را در گوسفندهای با بیماری اسهال مورد بررسی قرار دادند و فراوانی بیوتایپ A را گزارش کردند (6). در مطالعه‌ای که توسط Wani و همکاران در سال 2018 در مورد ژن‌های حدت کلستریدیوم پرفرنجنس ماهی‌های آب شیرین در هند با تکنیک Multiplex-PCR انجام شد فقط کلستریدیوم پرفرنجنس بیوتایپ A را گزارش نمودندکه نشان دهنده اهمیت و فراوانی این بیوتایپ باکتری می‌باشد (7). در مطالعه Matsuda و همکاران در سال 2019 شیوع و تنوع ژنتیکی توکسین‌های کلستریدیوم پرفرنجنس را در 798 ایزوله بالینی مورد بررسی قرار دادند و به هفت توکسینوتایپ تقسیم بندی کردند و ژن آلفا توکسین را شایع‌ترین توکسین گزارش کردند (8). تنوع ژنتیکی می‌تواند تنوع فنوتیپی، توزیع جغرافیایی باکتری‌ها، ویژگی‌های میزبان، بیماریزایی، مقاومت آنتی‌بیوتیکی و حدت را توضیح دهد. تعیین بیوتایپ سویه باکتریایی به ویژه برای تشخیص، درمان و نظارت اپیدمیولوژیک مهم است (9). برای این منظور، می‌توان از مجموعه‌ای از روش‌های ساده فنوتیپی مانند آزمایش بیوشیمی یا تعیین سروتیپ، استفاده از اختلاف در ساختار، فعالیت بیوشیمیایی و آنزیمی یا ترکیب آنتی‌ژنی میکروارگانیسم داده شده استفاده نمود. علاوه بر این، می‌توان از روش‌های پیچیده‌تر ژنوتیپی برای ایجاد تمایز حساس‌تر بین سویه‌ها و داشتن میزان بالاتر افتراق در مقایسه با روش فنوتیپی استفاده کرد. طی دو دهه گذشته روش‌های مولکولی همچون روش‌های مبتنی بر الگوی باندهایDNA  (DNA Binding Pattern) جایگزین روش‌های فنوتیپی برای تعیین نوع سویه‌های باکتریایی شده است (10). از شباهت الگوهای تولیدی می‌توان برای تمایز سویه‌ها و تجزیه و تحلیل رابطه ژنتیکی استفاده کرد. تعداد قطعات به دست آمده به فراوانی و توزیع مکان‌های برش به ویژه توسط آنزیم محدودالاثر در توالی نوکلئوتیدی کروموزوم باکتریایی بستگی دارد. یکی از روش‌های مبتنی بر الگوی باندهایDNA ، تکنیکPCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction- Restriction Fragment Length Polymorphism)  است. در این تکنیک اندازه قطعات محدود کننده را با الکتروفورز ژل معمولی پس از اثر برش آنزیم محدودالاثر که به طور معمول از هم جدا شده‌اند را اندازه می‌گیرد. در تکنیک PCR از آنجایی که پرایمرها به طور اختصاصی عمل می‌کنند، در نتیجه در بین انواع گونه‌های مختلف جانداران می‌توان یک گونه یا سویه خاص را ردیابی نمود. تکنیکRFLP  شامل تجزیه و تحلیل آمپلیکون‌های PCR است که با تکثیر توسط آغازگرها برای توالی‌های خاص مورد نظر به دست می‌آید. از این تکنیک برای شناخت چند شکلی‌های تک نوکلئوتیدی SNP (Single Nucleotide Polymorphism) و چند شکلی‌های چند نوکلئوتیدی MNP (Multiple Nucleotide Polymorphism)  استفاده می‌شود. این یک روش ارزان قیمت است که نیازی به ابزار پیشرفته ندارد. انتخاب آنزیم‌های محدودالاثر می‌تواند دشوار باشد زیرا چندین SNP بر روی همان سایت شناسایی آنزیم محدود‌الاثر می‌تواند وجود داشته باشد که ممکن است منجر به شناسایی تغییرات ژنتیکی شود. تجزیه و تحلیل رایانه‌ای تعداد و اندازه قطعات تولید شده از هر سویه، تجزیه و تحلیل فیلوژنتیک را هم فراهم می‌کند (11-15). هدف از انجام مطالعه حاضر استاندارد‌سازی و توسعه تکنیکPCR-RFLP  در شناسایی تنوع ژنتیکی کلستریدیوم پرفرنجنس بیوتایپ A است. در مطالعه حاضر جهت شناسایی تنوع ژنتیکی کلستریدیوم پرفرنجنس بر اساس روش مولکولی مبتنی بر الگوی باندهایDNA ، از تکنیک PCR-RFLP استفاده شد.

مواد و روش کار

تعداد 21 جدایه بیماریزای کلستریدیوم پرفرنجنس بیوتایپ A نگهداری شده در مؤسسه تحقیقات واکسن و سرم رازی شعبه جنوب شرق کشور، کرمان (کد اخلاق: IR.RVSRI.REC.1400.003) جهت انجام مطالعه حاضر انتخاب شدند و کشت مجدد در محیط کشت اختصاصی باکتری کلستریدیوم پرفرنجنس (Tryptose Sulfit Cycloserin)TSC  داده شد. محیط کشت‌ها همراه با اندیکاتور بی‌هوازی درون جار قرار داده شدند و توسط دستگاه آنوکسومت (Mart ساخت کشور هلند) بی‌هوازی گردیدند و به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‌گراد انکوباسیون شدند. از این تعداد 16 عدد جهت استخراجDNA  ژنومی نمونه‌ها با کیت GTP (IR) Cat No: DM05050 ساخت شرکت پیشگامان انتقال ژن ایران انتخاب شد. با هدف تأیید جدایه‌های کلستریدیوم پرفرنجنس بیوتایپ A، واکنش PCR با پرایمر آلفا (جدول 1) و با استفاده از واکنشگرها (جدول 2) انجام شد. برنامه دمایی PCR جهت تکثیر ژن آلفا شامل واسرشت اولیه 95 درجه سانتی‌گراد به مدت 7 دقیقه، 35 چرخه شامل واسرشت 94 درجه سانتی‌گراد به مدت 1 دقیقه، اتصال پرایمر در 5/52 درجه سانتی‌گراد به مدت 1 دقیقه و تکثیر 72 درجه سانتی‌گراد به مدت 90 ثانیه و چرخه تکثیر نهایی در 72 درجه سانتی‌گراد به مدت 10 دقیقه روی DNA نمونه‌ها انجام شد.

از سویه استاندارد کلستریدیوم پرفرنجنس تیپ A (ATCC13124) به عنوان کنترل مثبت و سویه کلستریدیوم سپتیکوم (CN913) به عنوان کنترل منفی استفاده گردید. سپس محصولاتPCR  با ولتاژ 90 به مدت 2 ساعت الکتروفورز شدند و پس از رنگ‌آمیزی و با استفاده از ژل داک عکسبرداری از روی ژل انجام شد.

در مرحله بعدی با استفاده از آنزیمPFU DNA Polymerase ، واکنش PCR جهت سنتز توالی کامل لوکوس ژنی توکسین آلفا و با استفاده از پرایمرهای اختصاصی زیر انجام گردید(16-18).

Forward: ccgGAATTCTCATATGTGGGATGGAAAAATTGAT

Reverse: ccgCTCGAGTTTATATTATAAGTTGAATTT

سپس جهت انجام تکنیک RFLP برش آنزیمی آمپلیکون‌های سنتز شده در دمای 65 درجه سانتی‌گراد با آنزیم محدودالاثرMse1  (10 U/µL, Thermo Fisher, Cat.: ER0982) بر اساس ترکیبات جدول 3 انجام شد. میکروتیوپ‌ها در دمای 65 درجه سانتی‌گراد به مدت 120 دقیقه قرار داده شدند. پس از خاتمه برش برای غیر فعال سازی آنزیم ازEDTA (Cat.:R1021)  5/0 مولار در8pH= به مقدار43/1 میکرولیتر استفاده شد (19، 20). در مرحله بعدی قطعات برش یافته با الکتروفورز بر روی ژل آگاروز 2 درصد از هم تفکیک شدند. ارزیابی تصاویر الکتروفورز با نرم افزار (1.52v)  ImageJانجام شد. این نرم افزار، نرم‌افزاری برای پردازش و کمی‌سازی تصاویر می‌باشد و در بسیاری از مسائل پردازش و تحلیل تصاویر به کار می‌رود. در آنالیزهای آماری مطالعه حاضر از نرم افزار (Numerical Taxonomy System personal computer, Ver:2.02) Ntsyspc که یک نرم افزار بسیار قدرتمند جهت انجام چندین آزمون آماری چند متغیره می‌باشد استفاده شد. این روش‌ها بر مبنای تعیین شباهت و یا فاصله ژنتیکی بین ژنوتیپ‌ها و گروه‌بندی آن‌ها بر مبنای تشابهات با استفاده از روش Neighbor Joining می‌باشد. مهم‌ترین بخش نرم افزار  Ntsysتجزیه خوشه‌ای یاCluster Analysis  است. از این نرم افزار جهت رسم دندروگرام فیلوژنتیکی استفاده شد.

نتایج

ارزیابی بیوتایپ A در آزمایشات باکتری‌شناسی، بیوتایپ A کلستریدیوم پرفرنجنس را تأیید نمودند. تأیید مولکولی بیوتایپ باکتری نیز با انجام واکنش PCR اختصاصی برای تأیید حضور ژن آلفا (آمپلیکون bp 324) انجام و باکتری تأیید مولکولی گردید (تصویر 1). لوکوس ژنی آلفا نیز با پرایمرهای اختصاصی سنتز شد. اندازه آمپلیکون سنتز‌شدهbp  1134 می‌باشد که در تصویر 2 مشخص است.

جهت انجام تکنیک PCR–RFLP با استفاده از آنزیم محدودالاثر  Mse1در لوکوس ژنی توکسین آلفا (cpa) برش آنزیمی صورت گرفت. با بررسی باند‌ها از طرف '3→'5 تعداد پنج جایگاه برشTTAA  ایجاد شد که به ترتیب شش قطعه به طول‌های 16، 92، 179، 202، 325 و 377 جفت باز به دست آمد. همچنین از طرف '5→'3 هفت جایگاه برشAATT  مشاهده شد که به ترتیب هشت قطعه به طول‌های 19، 22، 70، 83، 96، 134، 139 و 629  جفت باز حاصل شد. نتایج الکتروفورز ژل آگارز حاصل از تکنیک PCR–RFLP و موقعیت و کیفیت باندها مشاهده و بررسی گردید (تصویر 3).

جهت آنالیز از نرم افزار ImageJ استفاده شد و شدت و پهنای باندDNA  به صورت درصد مورد مقایسه قرار گرفت. نتایج آنالیز قطعات برش یافته با اندازه‌های 200، 250، 350 و 400 جفت باز به ترتیب در تصاویر 4، 5، 6، 7 به صورت نمودار ستونی آورده شده است. خلاصه نتایج RFLP با نرم افزار ImageJ به صورت 0 و 1 در جدول 4 نمایش داده شده است. اگر درصد شدت و پهنای باندDNA  در اندازه‌‌های 200، 250، 350 و 400 جفت باز بیش از 3 درصد باشد به صورت عدد یک و کمتر از 3 درصد به صورت صفر در نظر گرفته شد و این اعداد در نرم افزار Ntsyspc به عنوان داده وارد شد و مورد پردازش قرار گرفت.

در مطالعه حاضر تشابه نمونه‌ها با یکدیگر و با کنترل‌های مثبت و منفی با نرم افزار Ntsyspc بررسی گردید و بر مبنای آن دندروگرام فیلوژنتیکی رسم گردید (تصویر 8). در این دندروگرام چهار گروه از همدیگر به شرح زیر متمایز شدند:

گروه اول شامل نمونه‌های HK2، HK5، HK9، HK10، HK18،  HK19و HK20 می‌باشند که شباهت و قرابت ژنتیکی بیشتری با سویه کنترل مثبت دارند. گروه دوم شامل نمونه‌هایHK6 ،HK7 ، HK13، HK16 و HK17 می‌باشند که شباهت و قرابت زنتیکی کمتری با سویه کنترل مثبت داشتند. گروه سوم شامل نمونه‌های HK21 و HK11 می‌باشند که با سویه کنترل مثبت از نظر ژنتیکی اختلاف داشتند. گروه چهارم شامل نمونه‌های HK8 و HK12 که شباهت و قرابت ژنتیکی بسیار به هم داشتند و در یک گروه قرار گرفتند.

بحث

توکسین آلفا دارای دو دامنه و یک ناحیه اتصال دهنده است، دامنه انتهاییN  مسئول فعالیت فسفولیپاز C و دامنه انتهایی C که در اتصال و وارد کردن توکسین به غشای سلولی برای فعالیت همولیتیک نقش دارد. جهش در هر نقطه از توالی ژنوم اثرات متفاوتی خواهد داشت زیرا توکسین آلفا به دلیل دارا بودن متالوآنزیم فسفولیپاز C دارای فعالیت‌های کشنده است و فعالیت‌های اسفنگومیلیناز، که باعث هیدرولیز فسفولیپیدها و اسفنگومیلین می‌شود منجر به آسیب بافتی و لیز سلول‌های خونی و سلول‌های اپیتلیال می‌شود (21). Li و همکاران در سال 2009 اثبات کردند که الگوهای RFLP عمدتاً ترکیب خاص آنزیم‌های برشی و پروب‌های اسید نوکلئیک می‌باشند و در تجزیه و تحلیل  RFLPدر باکتری شناسی، اگر دو سویه دارای فاصله متفاوت بین محل‌های برش برای یک آنزیم برشی خاص باشند، طول آن قطعات محدود کننده بین سویه‌ها متفاوت خواهد بود. این شباهت الگوهای تولید شده از قطعات محدود کننده می‌تواند برای تمایز سویه‌ها و تجزیه و تحلیل ژنتیکی استفاده شود (22).

بر این اساس، دو مجموعه اطلاعات برایPCR-RFLP ، یعنی آغازگرهای واکنش PCR و آنزیم‌های محدود کننده برایRFLP  اهمیت دارد و احتمال خطا کم است (23). اگر مولکول‌های متفاوت در نوکلئوتیدهای توالی ژنی یا‌SNP ها باشد، قطعات مختلف ممکن است ایجاد شود. قطعات را می‌توان با ژل الکتروفورز جدا کرد و عکس‌برداری نمود. تنوعات ژنتیکی مشاهده شده پس از برش آنزیمی با آنزیم محدود‌الاثرMse1  الگوهای مختلفی را در لوکوس ژنی توکسین آلفا نشان داد و می‌توان از آن‌ها پس از آنالیز برای شناسایی تنوع ژنتیکی استفاده نمود. این لوکوس ژنی در همه سویه‌ها وجود دارد و در واقع می‌توان به عنوان یک نشانگر مولکولی DNA استفاده شود. با کمک این نشانگرها، شناسایی ژن‌های کنترل کننده صفات کمی و کیفی امکان‌پذیر شده است. از آنجا که لوکوس ژنی توکسین آلفا یک نشانگر مولکولی DNA در کلستریدیوم پرفرنجنس محسوب می‌شود و به همین علت تکنیک PCR-RFLP روش ساده‌ای برای تخمین میزان روابط فیلوژنتیکی و تکاملی جایگزینی بازها از طریق مطالعات مقایسه‌ای توالی‌های نوکلئوتیدی می‌باشد.

در مطالعه Baffoni و همکاران در سال 2013 شناسایی گونه‌های جنس بیفیدوباکتریوم (Bifidobacterium) را با استفاده از تکنیکPCR-RFLP  انجام دادند و گزارش کردند که با استفاده از این تکنیک به طور مؤثری می‌توان بیوتایپ‌های مختلف این باکتری را شناسایی نمود (24). Álvarez-Pérez و همکاران در سال 2018 از تعداد 80 جدایه کلستریدیوم پرفرنجس متعلق به بیوتایپ A با استفاده از تکنیک مشابه RFLP تشابهات تنوع ژنتیکی را در چهار گروه شناسایی کردند (25). در مطالعه حاضر از تعداد 16 جدایه کلستریدیوم پرفرنجس بیوتایپA ، با استفاده از تکنیک RFLP تشابهات تنوع زنتیکی در چهار گروه نیز شناسایی شد. Sparks و همکاران در سال 2001 ژنوتایپینگ جدایه‌های کلستریدیوم پرفرنجس انتروتوکسیژنیک را با تکنیک RFLP انجام دادند. همچنین این محققین تعدادی از جدایه‌های کلستریدیوم پرفرنجس با بررسی ژن cpe  به منظور تعیین مخزن مسمومیت‌های غذایی مورد بررسی قرار دادند (26). Keto-Timonen و همکاران در سال 2006 گزارش کردند که با استفاده از تکنیک PCR-RFLP می‌توان سویه‌های مختلف کلستریدیوم پرفرنجس را تشخیص داد (27). این محققین از 37 گونه کلستریدیوم پرفرنجنس جدا شده از مواد غذایی با استفاده از تکنیک PCR تعداد پنج تیپ اصلی و با استفاده از تکنیک PCR-RFLP تعداد 29 سویه با تنوع ژنتیکی متفاوت تشخیص دادند (27). Dorn-In و همکاران در سال 2022 از تکنیک RFLP با موفقیت برای ارزیابی آلودگی مواد غذایی به گونه‌های مختلف کلستریدیوم در راستای فساد مواد غذایی استفاده کردند (28). این مطالعه شامل اولین تجزیه و تحلیل ژنوتیپ جدایه‌های مدفوعیcpe  مثبت به دست آمده از بیماران مبتلا به اسهال گوارشی ناشی از مواد غذایی در آمریکای شمالی است. این محققین از تعداد 65 سویه جنس کلستریدیوم با استفاده از تکنیک‌های مختلف از جمله تکنیک RFLP به دو گروه اصلی تقسیم بندی کردند. Liveris و همکاران در سال 1995 مشخص نمودند که تکنیک PCR-RFLP مطالعه بین جدایه‌ها را تسهیل می‌کند (29). این محققین از تعداد 35 گونه بورلیا بورگدورفری (Borrelia burgdorferi) با استفاده از تکنیک RFLP به دو گروه اصلی از نظر تنوع ژنتیکی شناسایی کردند. Shields و Olson در سال 2003 از تکنیک RFLP برای افتراق گونه‌های سیکلوسپورا (Cyclospora) در آب‌های محیطی بدون انجام آزمایشات باکتریایی استفاده نمودند (30). Fisher و همکاران در سال 2005 با تکنیک RFLP ترتیب توالی‌های DNA پلاسمیدی PF5603 ژن کد‌کننده توکسین CPB2 جدایه‌های کلستریدیوم پرفرنجنس انتروتوکسوژنیک بیوتایپA  در بیماری‌های گوارشی انسان به دست آوردند (31). Waters و همکاران در سال 2003 با تکنیک RFLP ترتیب توالی‌هایDNA  ژن کدکننده توکسین CPB2 جدایه‌های کلستریدیوم پرفرنجنس انتروتوکسوژنیک بیوتایپA  را در خوکچه به دست آوردند (32). Alvarez-Perez و همکاران در سال 2017 با آزمایش بر روی 80 سویه کلستریدیوم پرفرنجنس با تکنیک PCR-RFLP وضعیت تنوع ژنتیکی و حساسیت به داروی مترونیدازول را بررسی کردند. آن‌ها گزارش کردند که با تکنیک RFLP تنوع ژنتیکی زیادی در بین کلستریدیوم پرفرنجنس بیوتایپ A بدون توجه به حساسیت می‌توان شناسایی نمود (33).

نتیجه‌گیری نهایی: مطالعه حاضر نشان داد که تکنیک PCR-RFLP به عنوان ابزاری کاربردی و تکنیکی قابل تکرار برای تایپینگ باکتری است و به طور مؤثر و با قدرت تمایز بالا می‌تواند سویه‌های مختلف کلستریدیوم پرفرنجنس بیوتایپ A را تفکیک نماید. زیرا جهش در ژنوم می‌تواند منجر به تغییر در تعداد محل‌های برش شود. این تکنیک سریع، آسان و ارزان به منظور تعیین ژنوتیپ SNP‌ها و واریانت‌های داخل گونه‌ای و بین گونه‌ای کاربرد دارد و پیشنهاد می‌شود از این تکنیک برای تشخیص دیگر سویه‌های مختلف استفاده شود.

سپاسگزاری

مطالعه حاضر در قالب اجرای پروژه تحقیقاتی مصوب به شماره 990531-072-18-85-2 مورد حمایت مؤسسه تحقیقات واکسن و سرم‌سازی رازی، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی انجام گرفته است. از تمام همکاران مؤسسه تحقیقات واکسن و سرم‌سازی رازی شعبه کرمان که ما را در انجام مطالعه حاضر یاری کردند تشکر و قدردانی می‌شود.

تعارض منافع

بین نویسندگان تعارض در منافع گزارش نشده است.

مراجع

  1. Freedman JC, Shrestha A, McClane BA. Clostridium perfringens enterotoxin: action, genetics, and translational applications. Toxins. 2016;8(3):73. doi: 10.3390/toxins8030073 PMID: 26999202
  2. Mehdizadeh Gohari I, A. Navarro M, Li J, Shrestha A, Uzal F, A. McClane B. Pathogenicity and virulence of Clostridium perfringens. Virulence. 2021;12(1):723-53. doi: 10.1080/21505594.2021.1886777 PMID: 33843463
  3. Leipig-Rudolph M, Busch K, Prescott JF, Mehdizadeh Gohari I, Leutenegger CM, Hermanns W, et al. Intestinal lesions in dogs with acute hemorrhagic diarrhea syndrome associated with netF-positive Clostridium perfringens type A. J Vet Diagn Invest. 2018;30(4):495-503. doi: 10.1177/1040638718766983 PMID: 29621942
  4. Rood JI, Adams V, Lacey J, Lyras D, McClane BA, Melville SB, et al. Expansion of the Clostridium perfringens toxin-based typing scheme. Anaerobe. 2018;53:5-10. doi: 10.1016/j.anaerobe.2018.04.011 PMID: 29866424
  5. Titball R, Naylor C, Miller J, Moss D, Basak A. Opening of the active site of Clostridium perfringens α-toxin may be triggered by membrane binding. Int J Med Microbiol. 2000;290(4-5):357-61. doi: 10.1016/s1438-4221(00)80040-5 PMID: 11111911
  6. Shoukat S, Munshi ZH, Wani SA, Ali M, Kashoo ZA, Shah SA, et al. Isolation, prevalence and molecular toxinotyping of Clostridium perfringens from healthy and diseased sheep of Kashmir, India. J Entomol Zool Stud. 2018;6(6):805-8.
  7. Wani N, Wani SA, Munshi Z, Ahmad S, Shah MR, Hussain A, et al. Isolation and virulence gene profiling of Clostridium perfringens from freshwater fish. J Entomol Zool Stud. 2018;6(3):176-81.
  8. Matsuda A, Aung MS, Urushibara N, Kawaguchiya M, Sumi A, Nakamura M, et al. Prevalence and genetic diversity of toxin genes in clinical isolates of Clostridium perfringens: Coexistence of alpha-toxin variant and binary enterotoxin genes (bec/cpile). Toxins. 2019;11(6):326. doi: 10.3390/toxins11060326 PMID: 31174364
  9. Anju K, Karthik K, Divya V, Priyadharshini MLM, Sharma RK, Manoharan S. Toxinotyping and molecular characterization of antimicrobial resistance in Clostridium perfringens isolated from different sources of livestock and poultry. Anaerobe. 2021;67:102298. doi: 10.1016/j.anaerobe.2020.102298 PMID: 33220406
  10. Molan K, Žgur Bertok D. Small prokaryotic DNA-binding proteins protect genome integrity throughout the life cycle. Int J Mol Sci. 2022;23(7):4008. doi: 10.3390/ijms23074008 PMID: 35409369
  11. Schürch A, Arredondo-Alonso S, Willems R, Goering R. Whole genome sequencing options for bacterial strain typing and epidemiologic analysis based on single nucleotide polymorphism versus gene-by-gene–based approaches. Clin Microbiol Infect. 2018;24(4):350-4. doi: 10.1016/j.cmi.2017.12.016 PMID: 29309930
  12. Bush SJ, Foster D, Eyre DW, Clark EL, De Maio N, Shaw LP, et al. Genomic diversity affects the accuracy of bacterial single-nucleotide polymorphism–calling pipelines. GigaScience. 2020;9(2):1-21. doi: 10.1093/gigascience/giaa007 PMID: 32025702
  13. Mahamat Abdelrahim A, Radomski N, Delannoy S, Djellal S, Le Négrate M, Hadjab K, et al. Large-scale genomic analyses and toxinotyping of Clostridium perfringens implicated in foodborne outbreaks in France. Front Microbiol. 2019;10:777. doi: 10.3389/fmicb.2019.00777 PMID: 31057505
  14. Ronco T, Stegger M, Ng KL, Lilje B, Lyhs U, Andersen PS, et al. Genome analysis of Clostridium perfringens isolates from healthy and necrotic enteritis infected chickens and turkeys. BMC Res Notes. 2017;10(1):1-6. doi: 10.1186/s13104-017-2594-9 PMID: 28693615
  15. Lacey JA, Johanesen PA, Lyras D, Moore RJ. Genomic diversity of necrotic enteritis-associated strains of Clostridium perfringens: a review. Avian Pathol. 2016;45(3):302-7. doi: 10.1080/03079457.2016.1153799 PMID: 26949841
  16. Abildgaard L, Engberg RM, Pedersen K, Schramm A, Hojberg O. Sequence variation in the α-toxin encoding plc gene of Clostridium perfringens strains isolated from diseased and healthy chickens. Vet Microbiol. 2009;136(3-4):293-9. doi: 10.1016/j.vetmic.2008.11.001 PMID: 19070974
  17. Rana EA, Nizami TA, Islam MS, Barua H, Islam MZ. Phenotypical identification and toxinotyping of Clostridium perfringens isolates from healthy and enteric disease-Affected chickens. Vet Med Int. 2023;2023:2584171. doi: 10.1155/2023/2584171 PMID: 36818644
  18. Hustá M, Ducatelle R, Van Immerseel F, Goossens E. A rapid and simple assay correlates in vitro NetB activity with Clostridium perfringens pathogenicity in chickens. Microorganisms. 2021;9(8):1708. doi: 10.3390/microorganisms9081708 PMID: 34442787
  19. Sheeja TE, Kumar IPV, Giridhari A, Minoo D, Rajesh MK, Babu KN. Amplified fragment length polymorphism: applications and recent developments. Methods Mol Biol. 2021;2222:187-218. doi: 10.1007/978-1-0716-0997-2_12 PMID: 33301096
  20. Paun O, Schönswetter P. Amplified fragment length polymorphism: an invaluable fingerprinting technique for genomic, transcriptomic, and epigenetic studies. Plant DNA Fingerprinting and Barcoding: Methods Protoc. 2012:75-87. doi: 10.1007/978-1-61779-609-8_7 PMID: 22419490
  21. Sakurai J, Nagahama M, Oda M. Clostridium perfringens alpha-toxin: characterization and mode of action. J Biochem. 2004;136(5):569-74. doi: 10.1093/jb/mvh161 PMID: 15632295
  22. Li W, Raoult D, Fournier P-E. Bacterial strain typing in the genomic era. FEMS Microbiol Rev. 2009;33(5):892-916. doi: 10.1111/j.1574-6976.2009.00182.x PMID: 19453749
  23. Chuang L-Y, Yang C-H, Tsui K-H, Cheng Y-H, Chang P-L, Wen C-H, et al. Restriction enzyme mining for SNPs in genomes. Anticancer Res. 2008;28(4A):2001-7. PMID: 18649739
  24. Baffoni L, Stenico V, Strahsburger E, Gaggìa F, Di Gioia D, Modesto M, et al. Identification of species belonging to the Bifidobacterium genus by PCR-RFLP analysis of a hsp60 gene fragment. BMC Microbiol. 2013;13(1):1-9. doi: 10.1186/1471-2180-13-149 PMID: 23815602
  25. Alvarez-Perez S, Blanco JL, Astorga RJ, Gomez-Laguna J, Barrero-Dominguez B, Galan-Relano A, et al. Distribution and tracking of Clostridium difficile and Clostridium perfringens in a free-range pig abattoir and processing plant. Food Res Int. 2018;113:456-64. doi: 10.1016/j.foodres.2018.07.040 PMID: 30195542
  26. Sparks SG, Carman RJ, Sarker MR, McClane BA. Genotyping of enterotoxigenic Clostridium perfringens fecal isolates associated with antibiotic-associated diarrhea and food poisoning in North America. J Clin Microbiol. 2001;39(3):883-8. doi: 10.1128/JCM.39.3.883-888.2001 PMID: 11230399
  27. Keto-Timonen R, Heikinheimo A, Eerola E, Korkeala H. Identification of Clostridium species and DNA fingerprinting of Clostridium perfringens by amplified fragment length polymorphism analysis. J Clin Microbiol. 2006;44(11):4057-65. doi: 10.1128/JCM.01275-06 PMID: 16971642
  28. Dorn-In S, Mang S, Schwaiger K. Unknown cold-tolerant Clostridium spp.: characteristics and potential to cause meat spoilage. Food Microbiol. 2022;102:103916. doi: 10.1016/j.fm.2021.103916 PMID: 34809943
  29. Liveris D, Gazumyan A, Schwartz I. Molecular typing of Borrelia burgdorferi sensu lato by PCR-restriction fragment length polymorphism analysis. J Clin Microbiol. 1995;33(3):589-95. doi: 10.1128/jcm.33.3.589-595.1995 PMID: 7751362
  30. Shields JM, Olson BH. PCR-restriction fragment length polymorphism method for detection of Cyclospora cayetanensis in environmental waters without microscopic confirmation. Appl Environ Microbiol. 2003;69(8):4662-9. doi: 10.1128/AEM.69.8.4662-4669.2003 PMID: 12902255
  31. Fisher DJ, Miyamoto K, Harrison B, Akimoto S, Sarker MR, McClane BA. Association of beta2 toxin production with Clostridium perfringens type A human gastrointestinal disease isolates carrying a plasmid enterotoxin gene. Mol Microbiol. 2005;56(3):747-62. doi: 10.1111/j.1365-2958.2005.04573.x PMID: 15819629
  32. Waters M, Savoie A, Garmory HS, Bueschel D, Popoff MR, Songer JG, et al. Genotyping and phenotyping of beta2-toxigenic Clostridium perfringens fecal isolates associated with gastrointestinal diseases in piglets. J Clin Microbiol. 2003;41(8):3584-91. doi: 10.1128/JCM.41.8.3584-3591.2003 PMID: 12904359
  33. Alvarez-Perez S, Blanco JL, García ME. Clostridium perfringens type A isolates of animal origin with decreased susceptibility to metronidazole show extensive genetic diversity. Microb Drug Resist. 2017;23(8):1053-8. doi: 10.1089/mdr.2016.0277 PMID: 28346849
مجله تحقیقات دامپزشکی (Journal of Veterinary Research)
دوره 78، شماره 2
تیر 1402
صفحه 145-156

فایل ها

هم رسانی

ارجاع به این مقاله

آمار