نوع مقاله : انگل شناسی و بیماری های انگلی
نویسندگان
1 دانش آموخته دانشکده دامپزشکی، دانشگاه تهران، تهران، ایران
2 گروه انگل‌شناسی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه تهران، تهران، ایران
3 گروه زیست مواد دارویی، دانشکده داروسازی، دانشگاه علوم پزشکی تهران، تهران، ایران
چکیده
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
BACKGROUND: Toxocara canis C-type lectin (T. canis-CTL) is the main protein part of the secretory-excretory product secreted by Toxocara canis infective larvae. T. canis-CTL can stimulate immune response-mediated regulatory T lymphocytes, increase the FOXP3+ cells population, and reduce severe inflammatory responses. T. canis-CTL is a promising candidate for immune modulation in some autoimmune diseases, deserving further investigation.
OBJECTIVES: The current research aimed to purify the recombinant T. canis-CTL under denaturation and native condition to increase exploration and maintain biological activity.
METHODS: The expression vector, pET32a was constructed with the partial sequence 660bp of T. canis-CTL and expressed in E. coli BL21 (DE3). T. canis-CTL protein expression was induced by IPTG (1 mM) at 37°C after 6 h. In this study, different buffers were used for cell explosion and recombinant protein solubilization, including lysis buffer with urea (8 M, pH=8) and lysozyme enzyme as well as lysis buffer with Imidazole (0.01 M) and lysozyme enzyme, and previous buffers in addition to sonication. The effect of these buffers was evaluated in bacterial cells explosion, using Gram-staining and microscopic examination. Recombinant T. canis-CTL protein was extracted and purified under denaturation and native condition using Ni-NTA affinity chromatography by agarose and sepharose resin. A New Zealand male rabbit was immunized with the recombinant protein to evaluate the bioactivity of the protein.
RESULTS: Lysis buffer with urea (8 M, pH=8) and lysozyme enzyme, in addition to sonication, provided acceptable results, and an additional amount of recombinant T. canis-CTL protein was secreted in the buffer. Protein purification under denaturation conditions with Ni-NTA agarose affinity chromatography also provides further recombinant protein. Most of the induction of recombinant T. canis-CTL with 41 KDa molecular weight was collected 6 h after induction at 37°C. Dot-blot results illustrate the brown dot, which showed a 1:500 titer of specific IgG polyclonal antibody has developed in the sera of rabbits immunized with T. canis-CTL recombinant protein.
CONCLUSIONS: The denaturation condition did not affect the biological activity of the T. canis-CTL recombinant protein and can recover a further amount of recombinant proteins.
کلیدواژه‌ها [English]
توکسوکارا کنیس کرم گرد سگ با انتشار جهانی می‌باشد، که تعداد زیادی از پستانداران از جمله انسان را نیز آلوده می‌کند. توکسوکاریازیس از مهم‌ترین بیماریهای انگلی مشترک انسان و دام می‌باشد و به عنوان تهدیدی برای بهداشت عمومی جامعه معرفی شده است (1). تخم‌های حاوی نوزاد عفونت‌زا میزبان‌های حامل (پاراتنیک) شامل مرغ، گاو، بره، خوک، انسان و موش را نیز آلوده می‌کنند، اما نوزادها در میزبان‌های حامل بالغ نمی‌شوند و از طریق بافت نرم مهاجرت می‌کنند و برای مدت طولانی حتی تا سال‌ها در بدن باقی می‌مانند (2). توکسوکارا کنیس به عنوان یک نماتود برای مدت طولانی در بافت‌های بدن زندگی و از سیستم ایمنی میزبان فرار می‌کند. لکتین نوع سی یکی از گلیکوپروتئین‌هایی است که در مرحله نوزادی این انگل به مقدار زیاد ترشح می‌شود. نوزادهای انگل توکسوکارا کنیس در بافت میزبان‌های حامل، پروتئین‌هایی از خانواده گلیکوپروتئین‌ها از جمله لکتین نوع سی را از کوتیکول خود دفع می‌کنند (3).
محصولات دفعی- ترشحی گونه‌های توکسوکارا عمدتاً از لکتین‌ها تشکیل شده‌اند، که هدف‌های مناسبی برای گیرنده‌های لکتین نوع سی انسان می‌باشند، با این‌حال، طیف وسیعی از گیرنده‌های لکتین نوع سی میزبان‌ها که گونه‌های توکسوکارا را تشخیص می‌دهند، هنوز ناشناخته است (4).
لکتین‌های نوع سی، خانواده‌ای از گلیکوپروتئین‌های وابسته به کلسیم می‌باشند که در قلمرو تشخیص کربوهیدرات (Carbohydrate-Recognition Domains) به مونو و الیگوساکاریدها متصل می‌شوند. این پروتئین‌ها می‌توانند عوامل بیماریزا را شناسایی و در واکنش متقابل سلول‌ها شرکت کنند. خانواده پروتئین‌های دارای قلمرو لکتین نوع سی، در پستاندارانی که به عنوان میزبان حامل معرفی شده‌اند، در پاسخ‌های ایمنی نقش دارند. لکتین نوع سی توکسوکارا کنیس (T.canis-CTL) یکی از گلیکوپروتئین‌های ترشح شده از نوزاد این نماتود با 219 اسید‌آمینه و حاوی یک قلمرو تشخیص کربوهیدرات است، در حالی که لکتین‌های نوع سی در برخی نماتودها مانند آنکیلوستوما سیلانیکوم، نکاتور امریکانوس، همونکوس کونتورتوس، سنورابدیتیس الگانس دارای دو یا چند قلمرو تشخیص کربوهیدرات می‌باشند. این خانواده از پروتئین‌ها علاوه بر انگل‌های کرمی و نماتودهای آزادزی در سایر حیوانات بی‌مهره و مهره‌داران یافت شده‌اند. لکتین نوع سی توکسوکارا کنیس به عنوان یک پروتئین مهم در ایمنی‌زایی و واکنش متقابل میزبان-انگل در نظر گرفته شده است. توالی‌های لکتین نوع سی توکسوکارا کنیس با توالی‌هایی از پروتئین‌های دارای لکتین نوع سی که در پاسخ‌های ایمنی پستانداران نقش دارند، همردیف شدند و نتایج حاصل مناطق بسیار حفاظت شده را در جایگاه چهار سیستئین نشان دادند که دو پیوند دی‌سولفیدی را تشکیل دادند و برای تشکیل ساختار پروتئین، حیاتی می‌باشند. پروتئین لکتین نوع سی توکسوکارا کنیس چهار نوع است، نوع یک و چهار پروتئین‌های دفعی- ترشحی می‌باشند. غلظت نوع یک در بین پروتئین‌های دفعی- ترشحی بیشتر است. این پروتئین‌ها در تعدیل سیستم ایمنی نقش دارند و سبب کاهش واکنش‌های التهابی در میزبان می‌شوند. ژن کدکننده پروتئین لکتین نوع سی توکسوکارا کنیس دارای توالی بسیار حفاظت شده است و به طور اختصاصی در نوزاد عفونت‌زا بیان می‌شود (1)، این پروتئین می‌تواند به منظور افزایش سلول‌های T تنظیمی در بیماریهای خودایمن ناشی از افزایش فاکتورهای التهابی به عنوان یک پروتئین درمانی مورد توجه قرارگیرد.
برای تخلیص تمام پروتئین‌ها یک روش یکسان به کار نمی‌رود و بسته به هدف مطالعه، شرایط و مراحل خالص‌سازی یک پروتئین بایستی بهینه‌سازی شود. بنابراین، ممکن است فرآیند تخلیص یک پروتئین با پروتئین دیگر متفاوت باشد (5). به منظور دستیابی به سطح بالای خلوص پروتئین، معمولاً تکنیک‌های قابل دسترس مانند تبادل کاتیونی و آنیونی در محدوده pHهای مختلف و کروماتوگرافی تمایلی به کار می‌روند. اساس کروماتوگرافی تمایلی استفاده از یون‌های فلزی برای تخلیص پروتئین‌های نوترکیب دارای دنباله هیستیدینی است. برای جداسازی پروتئین نوترکیب متصل شده به رزین در حالت طبیعی از شیب غلظت ایمیدازول به عنوان مولکول رقیب هیستیدین و در شرایط واسرشته از تغییر pH برای جداسازی پروتئین مورد نظر استفاده می‌شود (6). در مطالعه حاضر افزایش بازیابی و حفاظت فعالیت‌زیستی پروتئین نوترکیب لکتین نوع سی توکسوکارا کنیس در دو شرایط واسرشته و طبیعی مورد ارزیابی قرار گرفت.
بیان پروتئین نوترکیب لکتین نوع سی توکسوکارا کنیس: در مطالعه حاضر باکتری E.coli BL21(DE3) حاوی پلاسمید دارای ژن لکتین نوع سی توکسوکارا کنیس به منظور بیان و تخلیص پروتئین نوترکیب استفاده شد. این باکتری حاوی پلاسمید نوترکیب در محیط مایع لوریا برتانی دارای آمپی‌سیلین 100 میکروگرم/میلی‌لیتر (شرکت داروسازی دانا، ایران) کشت داده شد و پس از 18 ساعت 2000 میکرولیتر از آن به 40 سی‌سی محیط مایع لوریا برتانی دارای آمپی‌سیلین اضافه و در انکوباتور شیکردار (300~ دور در دقیقه) در دمای 37 درجه سانتی‌گراد قرار داده شد و پس از گذشت 5/1 تا 2 ساعت جذب نوری آن به 6/0 تا 7/0 رسید (OD600nm= 0.6-0.7)؛ سپس 400 میکرولیتر از محلولIPTG 100 میلی‌مولار (Sigma-Aldrich, Germany) به محیط کشت افزوده (غلظت نهایی IPTG مورد استفاده 1 میلی‌مولار بود) و به مدت 6 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‌گراد در انکوباتور شیکردار (300~ دور در دقیقه) قرار داده شد. پس از مدت زمان 6 ساعت همه محیط کشت را درون لوله‌های فالکون 15 میلی‌لیتری ریخته و به مدت 20 دقیقه تحت 4000 دور در دقیقه سانتریفوژ شدند و رسوب حاصل جمع‌آوری گردید. 1000 میکرولیتر محیط کشت در ساعت‌های مختلف بیان جمع‌آوری و تا زمان بررسی با ژل سدیم‌دودسیل‌سولفات- پلی‌اکریل‌آمید در فریزر 20- درجه سانتی‌گراد نگهداری شد.
استخراج پروتئین نوترکیب لکتین نوع سی توکسوکارا کنیس: رسوب حاصل از کشت باکتری حاوی پلاسمید نوترکیب القا شده، به مدت 20 دقیقه در دمای اتاق قرار داده و کاملاً از حالت انجماد خارج شد. سپس به رسوب حاصل از 15 میلی‌لیتر محیط کشت 1500 میکرولیتر بافر لیزکننده اوره 8 مولار (اوره، تریس بیس، مونو سدیم دی هیدروژن فسفات) و همچنین به رسوب دیگر نیز 1500 میکرولیتر بافر لیزکننده ایمیدازول 01/0 مولار (ایمیدازول، سدیم کلراید، مونو سدیم دی هیدروژن فسفات) اضافه گردید و سپس در دمای اتاق به مدت 20 دقیقه به طوری که از کف کردن آن جلوگیری شود، مورد تکان شدید قرار گرفتند. پس از آن لیزوزیم 1 میلی‌گرم/میلی‌لیتر (DNA Biotech, Iran) به محلول‌های حاصل اضافه شد و به مدت 30 دقیقه به روی یخ منتقل شد و سپس در مجاورت یخ با استفاده از دستگاه اولتراسونیک(Hielscher, Germany) 6 سیکل10 ثانیه‌ای با قدرت 100 وات و 10 ثانیه استراحت بین هر سیکل سونیکه صورت گرفت تا از شکسته شدن دیواره باکتری‌ها اطمینان حاصل شود. به منظور تأیید شکسته شدن دیواره باکتری و آزادسازی کامل پروتئین‌های محلول تولید شده، نمونه‌ها در زیر میکروسکوپ مورد بررسی قرار گرفت. سپس میکروتیوپ‌ها به مدت 12 دقیقه در 14000 دور در دقیقه در دمای 4 درجه سانتی‌گراد سانتریفوژ شدند و مایع رویی که حاوی پروتئین محلول بود را جهت بررسی با ژل سدیم‌دودسیل‌سولفات- پلی‌اکریل‌آمید 12 درصد، جمع‌آوری و در فریزر 20- درجه سانتی‌گراد قرار داده و رسوب‌های حاصل از لاشه باکتری‌ها دور ریخته شدند.
تخلیص پروتئین تحت شرایط واسرشته با استفاده از رزین Ni-NTA agarose و Ni-NTA Sepharose: به رسوب‌های حاوی بافر لیزکننده اوره 8 مولار (8=pH) در مرحله استخراج، رزین Ni-NTA agarose (Qiagen, Germany) و Ni-NTA Sepharose (Noavaranzist, Iran) اضافه شد و به مدت 30 دقیقه به روی یخ به آرامی شیک شدند. سپس 600 میکرولیتر از این محلول به ستون منتقل کرده و به مدت 5 دقیقه تحت 270 دور در دقیقه سانتریفوژ شدند. ستون‌ها با استفاده از بافر شستشو(3/6=pH) به مدت 2 دقیقه تحت 890 دور در دقیقه سانتریفوژ شدند. در نهایت بافر حل‌شونده (5/4=pH) به ستون‌ها اضافه شد و پس از گذشت 5 دقیقه بر روی یخ تحت 890 دور در دقیقه به مدت 2 دقیقه سانتریفوژ شدند. محلول‌های خارج شده از هر ستون پس از هر مرحله، جمع‌آوری و بر روی ژل سدیم‌دودسیل‌سولفات- پلی‌اکریل‌آمید 12 درصد الکتروفورز شده و با رنگ آمیزی کوماسی‌بلو بررسی شدند.
تخلیص پروتئین تحت شرایط طبیعی با استفاده از رزین Ni-NTA agarose و Ni-NTA Sepharose: به رسوب‌های حاوی بافر لیزکننده ایمیدازول 01/0 مولار در مرحله استخراج رزین Ni-NTA agarose (Qiagen, Germany) و Ni-NTA Sepharose (Noavaranzist, Iran) اضافه شد و به مدت 30 دقیقه به روی یخ به آرامی شیک شدند. سپس 600 میکرولیتر از این محلول به ستون منتقل شده و ستون‌ها به مدت 10 ثانیه تحت 1000 دور در دقیقه سانتریفوژ شدند. پس از آن ستون‌ها با استفاده از بافر شستشو ایمیدازول 02/0 مولار به مدت 10 ثانیه تحت 1000 دور در دقیقه سانتریفوژ شدند. در نهایت بافر حل‌شونده ایمیدازول 25/0 مولار به ستون‌ها اضافه شد و پس از گذشت 5 دقیقه بر روی یخ 10 ثانیه تحت 1000 دور در دقیقه سانتریفوژ شدند. محلول‌های خارج شده از هر ستون پس از هر مرحله، جمع‌آوری و بر روی ژل سدیم‌دودسیل‌سولفات- پلی‌اکریل‌آمید 12 درصد و رنگ آمیزی کوماسی‌بلو بررسی شدند.
ایمن کردن خرگوش با پروتئین نوترکیب تخلیص شده: دو خرگوش نر سفید نیوزلندی ده هفته‌ای تهیه گردید. مقدار پروتئین‌های تخلیص شده با روش واسرشته و طبیعی با روش میکروبرادفورد در طول موج 595 نانومتر با دستگاه میکرو اسپکتروفتومتر (Bio-Rad, USA) اندازه‌گیری شد. از پروتئین نوترکیب لکتین نوع سی توکسوکارا کنیس تخلیص شده با روش واسرشته به میزان 500 میکرولیتر (250 میکروگرم پروتئین نوترکیب تخلیص شده در 500 میکرولیتر بافر (4/7=pH) (PBS آماده و با حجم برابر (1:1) با ادجوانت کامل فروند (مؤسسه تحقیقات واکسن و سرم‌سازی رازی، ایران) تهیه شد. محتویات تهیه شده برای هر تزریق با استفاده از فیلترهای 45/0 میکرومتری استریل شدند (Membrane, USA). سپس به صورت زیرجلدی در دو ناحیه پشت کتف خرگوش تزریق انجام شد. در فاصله 14 روز، تزریق دوم و سوم (هفته دوم و سوم هرکدام یک تزریق) با 125 میکروگرم پروتئین نوترکیب تخلیص شده با روش واسرشته در 500 میکرولیتر بافر (4/7=pH) PBS و 500 میکرولیتر ادجوانت ناقص فروند (مؤسسه تحقیقات واکسن و سرم‌سازی رازی، ایران) انجام شد. خرگوش دوم به عنوان کنترل در نظر گرفته شده بود و تزریق‌ها دقیقاً مانند خرگوش قبلی با PBS استریل انجام شد. از هر دو خرگوش یک هفته پس از آخرین تزریق خونگیری به عمل آمد، سرم‌ها جدا و تا زمان انجام آزمایش دات‌بلات در دمای 80- درجه سانتی‌گراد نگهداری شدند.
ادجوانت کامل فروند یک روغن معدنی می‌باشد که حاوی سوسپانسیونی از مایکوباکتریوم توبرکلوزیس کشته شده با حرارت است که همراه با محلولی از آنتی‌ژن، T.canis-rCTL به شکل یک امولسیون آب در روغن به خرگوش‌ها تزریق شد، این امولسیون باعث تقویت پاسخ ایمنی سلولی و هومورال به آنتی‌ژن تزریقی می‌گردد. مایکوباکتری‌های موجود در ادجوانت کامل فروند، ماکروفاژها و سایر سلول‌ها را به محل تزریق جذب می‌کنند که باعث تقویت واکنش ایمنی می‌شود. این امولسیون روغنی اگر بدون باکتری باشد ادجوانت ناقص فروند نامیده می‌شود. ادجوانت فروند (اولین بار توسط ژول فروند در دهه 6224 ساخته شد) و تاکنون یکی از پرمصرف‌ترین ادجوانت‌های مورد استفاده در مطالعات می‌باشد که برای آزادسازی پیوسته آنتی‌ژن‌ها به منظور تحریک پاسخ ایمنی قوی و پایدار در برابر آنتی‌ژن‌ها استفاده می‌شود. عیب اصلی ادجوانت فروند این است که می‌تواند باعث ایجاد گرانولوما و التهاب در محل تلقیح شود، به همین دلیل برای تزریقات اولیه از ادجوانت کامل فروند و برای به حداقل رساندن عوارض جانبی دوز یادآور (بوستر)، از ادجوانت ناقص فروند استفاده می‌شود (7).
دات‌بلات: 1 میکرولیتر از پروتئین نوترکیب لکتین نوع سی توکسوکاراکنیس تخلیص شده تحت شرایط واسرشته با غلظت 192 میکروگرم/میلی‌لیتر به دست آمده از روش واسرشته با رزین نیکل-نیتریلوتری‌استیک‌اسید سفاروز بر روی کاغذهای نیتروسلولز 1´1 سانتیمتر مربع (USA، Bio-Rad) لکه‌گذاری و به مدت 30 دقیقه در دمای اتاق انکوبه شد. دو مرتبه شستشو با بافر TBST (Tris Buffer Salin+Tween20) 05/0 درصد به مدت 10 دقیقه بر روی شیکر به آهستگی صورت گرفت. نقاط غیراختصاصی موجود بر روی کاغذ توسط بافر TBST 5/0 درصد حاوی شیرخشک بدون چربی 3 درصد به مدت 1 ساعت به آرامی شیک و مسدود شدند. پس از گذشت 1 ساعت مایع بلاکر را دور ریخته و 2 بار با بافر TBST 05/0 درصد و هر بار به مدت 10 دقیقه شستشو صورت گرفت. سرم خرگوش ایمن شده و سرم خرگوش کنترل (سرم خرگوشی که با پروتئین T.canis-CTL چالش نشده است) با رقت 500:1 اضافه شده و به مدت 1 ساعت در دمای اتاق بر روی شیکر با سرعت آرام انکوبه گردید. شستشو مانند مراحل قبل انجام شد. سپس آنتی‌بادی Goat anti-Rabbit IgG کنژوگه شده با آنزیم HRP (RaziBiotech, Iran) با رقت 2000:1 به کاغذها اضافه و در دمای اتاق به آرامی شیک شدند. این‌بار 3 مرتبه شستشو (هر مرتبه 10دقیقه) به شکلی که 2 مرتبه اول بافرTBST 05/0 درصد و مرتبه آخر با بافر TBS انجام شد. از 3/3 دیآمینوبنزیدین DAB (Sigma-Aldrich, Germany) در حضور پراکسید‌هیدروژن به عنوان سوبسترای آنزیم استفاده و نتیجه حضور یا عدم حضور لکه رنگی پس از 15-5 دقیقه مشاهده شد و در پایان از آب مقطر به منظور متوقف کردن واکنش استفاده گردید. سپس کاغذها را در دمای اتاق قرار داده تا کاملاً خشک شوند.
نتایج مطالعه حاضر بر روی ژل سدیم‌دودسیل‌سولفات-پلی‌آکریل‌آمید 12 درصد با رنگ‌آمیزی کوماسی‌برلیانت‌بلو نشان داد که بیشترین میزان بیان پروتئین نوترکیب لکتین نوع سی توکسوکارا کنیس در ساعت ششم پس از القا حاصل می‌گردد (تصویر 1).
پس از القا و استخراج پروتئین نوترکیب لکتین نوع سی توکسوکارا کنیس، برای تخلیص در یک گروه از سلول‌های باکتریایی از بافر اوره 8 مولار (8=pH) و در گروه دیگر از بافر ایمیدازول 01/0 مولار به عنوان بافر لیزکننده استفاده شد و سپس لیزوزیم 1 میلی‌گرم/میلی‌لیتر اضافه گردید و همراه با سونیکه کردن سلول‌های باکتری شکسته و پروتئین نوترکیب بیان شده وارد محلول شد. از مراحل مختلف شکستن دیواره سلولی باکتری لام تهیه شد و نتیجه با رنگ‌آمیزی گرم نشان داد که در بافر لیز حاوی اوره 8 مولار (8=pH) و لیزوزیم 1 میلی‌گرم/میلی‌لیتر همراه با سونیکه، تمام باکتری‌ها شکسته شدند (تصویر 2-2) و بافر لیز حاوی ایمیدازول 01/0 مولار و لیزوزیم 1 میلی‌گرم/میلی‌لیتر همراه با سونیکه کردن، سبب شکسته شدن تعداد زیادی از باکتری‌ها شد (تصویر 4-2). اما در لام‌های تهیه شده از باکتری‌ها در بافر لیز حاوی اوره 8 مولار (8=pH) و لیزوزیم 1 میلی‌گرم/میلی‌لیتر (تصویر 1-2) و بافر لیز حاوی ایمیدازول 01/0 مولار و لیزوزیم 1 میلی‌گرم/میلی‌لیتر بدون سونیکه کردن (تصویر 3-2) تعداد زیادی از سلول‌ها بدون تغییر باقی ماندند.
در نتایج مطالعه حاضر استخراج پروتئین نوترکیب لکتین نوع سی توکسوکارا کنیس با بافر لیزکننده اوره 8 مولار و بافر لیزکننده ایمیدازول 01/0 مولار توسط لیزوزیم و سونیکه کردن، بر روی ژل پلی‌اکریل‌آمید 12 درصد نشان داد که میزان پروتئین استخراج شده در بافر لیزکننده اوره 8 مولار بیشتر بود. در روش تخلیص تحت شرایط واسرشته نیز مقدار پروتئین حاصل بیشتر بود (تصویر 3) و در اندازه‌گیری با روش میکروبرادفورد نیز این نتایج تأیید شد که پروتئین تخلیص شده با رزین آگاروز تحت شرایط واسرشته 335 میکروگرم/میلی‌لیتر و تحت شرایط طبیعی 157 میکروگرم/میلی‌لیتر و با استفاده از رزین سفاروز تحت شرایط واسرشته 192 میکروگرم/میلی‌لیتر و تحت شرایط طبیعی 102 میکروگرم/میلی‌لیتر به دست آمد. مقایسه نتایج استخراج پروتئین نوترکیب در تکرار‌های مستقل نشان داد که روش‌های تخلیص مورد استفاده در مطالعه حاضر تکرار‌پذیر می‌باشد (تصویر 3- ستون 3 و 4).
نتایج ایمن‌سازی خرگوش با پروتئین نوترکیب لکتین نوع سی توکسوکارا کنیس تخلیص شده تحت شرایط واسرشته با روش دات‌بلات ارزیابی گردید و سرم خرگوش تا رقت 1:500 با پروتئین نوترکیب لکتین نوع سی توکسوکارا کنیس غلظت 192 میکروگرم/میلی‌لیتر واکنش داد (تصویر 4).
پلاسمید pET32a از سری پلاسمید‌های بدون سیگنال می‌باشد که پروتئین را به صورت اجسام انکلوژن (به شکل نامحلول) بیان می‌کند، علاوه بر این، دو دنباله شامل شش اسید‌آمینه هیستیدین و تیوردوکسین، به ترتیب در انتهای C و N توالی بیانی لکتین نوع سی توکسوکارا کنیس قرار می‌دهد. این تگ‌ها به منظور صرفه‌جویی در زمان و هزینه تخلیص پروتئین نوترکیب است و تأثیر منفی بر فعالیت‌های زیستی پروتئین ندارد. در مطالعه حاضر پلاسمید pET-32a به این دلیل انتخاب شد که یکی از پلاسمیدهایی می‌باشد که به طور اختصاصی برای کلون‌سازی، بیان و خالص‌سازی پروتئین‌های نوترکیب در اشریشیا کلی طراحی شده و چندین دهه است که به طور وسیع برای بیان پروتئین‌های نوترکیب مورد استفاده قرار گرفته است. این پلاسمید pET-32a حاوی ژن (Lactose Inhibitor) lacI می‌باشد که مانع بیان ژن RNA پلی‌مراز T7 تحت کنترل پروموتر lacUV5 و پروموتر T7lac می‌شود. باکتری BL21(DE3) یک میزبان بیانی می‌باشد و حامل ژن RNA پلی‌مراز T7 است که توسط پروموتور lacUV5 کنترل و با IPTG القا می‌شود (8).
Yari و همکاران در سال 2017 به منظور بیان و تخلیص هورمون نوترکیب پاراتیروئید انسانی از پلاسمید pET-32a و دو سویه باکتری اشریشیا کلی شامل BL21 و Rosetta-gami و ستون‌های Ni-NTA استفاده کردند و در نتایج خود اعلام کردند که پروتئین نوترکیب به طور قابل قبول در هر دو سویه بیان شده اما درصد پروتئین هدف به کل پروتئین در باکتری اشریشیا کلی Rosetta-gami بیشتر از اشریشیا کلی BL21 بود (9).
نتایج مطالعه Fong و همکاران در سال 2003 به منظور بیان TES-120 در باکتری E.coli نشان داد که در ساعت دوم پس از القا بیشترین میزان بیان حاصل شد. همچنین پروتئین نوترکیب TES-120 بیان شده با 45 سرم انسانی توکسوکاریازیس واکنش مثبت داد (10).
در مطالعه حاضر پس از چندین تلاش برای تعیین شرایط بهینه، بالاترین مقدار بیان پروتئین نوترکیب لکتین نوع سی توکسوکارا کنیس در باکتری اشریشیا کلی BL21(DE3) به روش القایی با 1 میلی‌مولار IPTG در دمای 37 درجه سانتی‌گراد به مدت شش ساعت حاصل شد (تصویر1). مطالعه Shahbakhsh و همکاران در سال 2021 به روی پروتئین نوترکیب لکتین نوع سی توکسوکارا کنیس در باکتری اشریشیا کلی BL21(DE3) و اشریشیا کلی BL21 نشان داد که میزان بیان پروتئین در باکتری اشریشیا کلی BL21(DE3) در ساعت چهارم پس از القا بیشتر بود (11). مقایسه نتایج الکتروفورز تخلیص پروتئین نوترکیب لکتین نوع سی در دو شرایط واسرشته و طبیعی نشان داد که با هر دو روش تحت شرایط واسرشته و طبیعی تخلیص انجام می‌شود و باند 41 کیلودالتون بر روی ژل سدیم‌دودسیل‌سولفات-پلی‌آکریل‌آمید 12 درصد رنگ‌آمیزی شده با کوماسی‌برلیانت‌بلو قابل مشاهده می‌باشد (تصویر3) اما مقدار پروتئین حاصل در تخلیص تحت شرایط واسرشته بیشتر از طبیعی است و اندازه‌گیری با روش میکروبرادفورد نیز مؤید این نتایج بود.
اغلب پروتئین‌های نوترکیب در اجسام انکلوژن تجمع می‌یابند و با استفاده از روش‌های ترکیبی محلول و خالص‌سازی می‌شوند. در مطالعه حاضر پس از القا و استخراج پروتئین نوترکیب لکتین نوع سی توکسوکارا کنیس لام میکروسکوپی تهیه و رنگ‌آمیزی شد و در باکتری اشریشیا کلی BL21(DE3) حاوی پلاسمید نوترکیب لکتین نوع سی توکسوکارا کنیس با استفاده از لیزوزیم میزان کمی از پروتئین مورد نظر وارد بخش محلول شد و همچنان تعداد زیادی از باکتری‌ها شکل ظاهری خود را حفظ کردند اما با روش لیزوزیم همراه با سونیکه کردن، باکتری‌ها شکل میله‌ای خود را از دست داده، دیواره سلولی شکسته شده و مقدار زیادی از پروتئین مورد نظر وارد بخش محلول شد (تصویر 2).
در مطالعه Abbaszadeh و همکاران در سال 2019 که با هدف انتخاب بهترین روش استخراج و تخلیص پروتئین نوترکیب تری‌پاراتید در میزبان اشریشیا کلی با استفاده از کروماتوگرافی تمایلی نیکل بود نیز از روش نیتروژن مایع برای له کردن سلول‌های باکتریایی استفاده کردند اما هدف مطالعه را تأمین نکرد لذا از تیمار با بافر شیمیایی همراه با سونیکه کردن استفاده کردند که با این روش بیش از 97 درصد پروتئین وارد فاز محلول شد و نتیجه مطلوب و قابل قبول، مشابه با مطالعه حاضر حاصل گردید (12).
نتایج سنجش دات‌بلات نشان داد که IgG پلی‌کلونال اختصاصی تولید شده در خرگوش چالش شده، می‌تواند پروتئین نوترکیب لکتین نوع سی توکسوکارا کنیس بیان شده در اشریشیا کلی BL21(DE3) را تشخیص دهد (تصویر 4) این یافته نشان داد که این پروتئین نوترکیب تخلیص شده، فعالیت زیستی خود را به درستی حفظ کرده و بنابراین تخلیص در شرایط واسرشته تأثیر نامطلوبی بر ایمنی‌زایی پروتئین نداشته است.
نتیجه‌گیری‌نهایی: مطالعه حاضر یک روش اصلاح شده برای محلول‌سازی و تخلیص پروتئین نوترکیب لکتین نوع سی توکسوکارا کنیس را در باکتری اشریشیا کلی BL21(DE3) معرفی کرد. پروتئین نوترکیب به شکل اجسام انکلوژن با پلاسمید pET-32a بیان شد. به منظور محلول‌سازی از بافرهای لیزکننده اوره و ایمیدازول حاوی لیزوزیم همراه با سونیکه کردن و برای تخلیص از کروماتوگرافی تمایلی با رزین نیکل-نیتریلوتری‌استیک‌اسید آگاروز و رزین نیکل-نیتریلوتری‌استیک‌اسید سفاروز استفاده شد و میزان پروتئین بازیابی شده بازدهی قابل قبول داشت. پروتئین نوترکیب لکتین نوع سی توکسوکارا کنیس، خاصیت ایمنی‌زایی خود را حفظ کرده و به عنوان یک مولکول زیستی برای اهداف مختلف قابل استفاده است. روش بهینه‌سازی مورد استفاده در مطالعه حاضر می‌تواند در تخلیص سایر پروتئین‌های نوترکیب که در اشریشیا کلی به شکل اجسام انکلوژن بیان می‌شوند نیز مورد استفاده قرار گیرد.
مطالعه حاضر با حمایت‌های مالی مرکز تحقیقات مالتیپل‌اسکلروزیس، پژوهشکده علوم اعصاب، دانشگاه علوم پزشکی تهران با کد اخلاق IR.TUMS.NI.REC.1400.033، کد طرح پژوهشیاری 52971-233-1-1400 و معاونت پژوهش و فناوری دانشکده دامپزشکی دانشگاه تهران انجام شد و مراحل آزمایشگاهی آن در آزمایشگاه مولکولی گروه انگل‌شناسی، دانشکده دامپزشکی دانشگاه تهران به انجام رسید، نویسندگان بدین ترتیب مراتب قدردانی خود را از حامیان، ابراز می‌دارند.
بین نویسندگان تعارض در منافع گزارش نشده است.
', './data/jvr/coversheet/cover_fa.jpg'))