بررسی مولکولی فراوانی ابتلا به بیماری دیستمپر سگ‎ها در شغال‌های (Canis aureus) تلف‌شده بر اثر تصادف جاده‎ای استان گلستان (گرگان)

نوع مقاله : پژوهشی کوتاه

نویسندگان

1 گروه محیط زیست، دانشکده شیلات و محیط زیست، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان، گلستان، ایران

2 دانش آموخته دانشکده شیلات و محیط زیست، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان، گلستان، ایران

10.22059/jvr.2024.369918.3411

چکیده

زمینه مطالعه: ویروس دیستمپر سگ‌ها (CDV=Canine distemper virus)، یک موربیلی ویروس با RNA تک­رشته­ای حاوی 6 ژن، عامل بیماری‌ کشنده دیستمپر در سگ­سانان است. میزبان اولیه ویروس تنها سگ­سانان وحشی و اهلی می‌باشند.
هدف: نظر به حضور گونه­هایی از سگ­سانان و گربه­سانان چون روباه ترکمنی (Volpus coras) و پلنگ ایرانی (Panthera pardus saxicolor) که جمعیت آن‌ها در نواحی استان گلستان رو به انقراض است، اطلاع از اپیدمیولوژی و همه‌گیری CDV در جمعیت پستانداران وحشی مستعد ابتلا، ضروری به ­نظر می­رسد. با‌توجه‌به حضور شغال­های طلائی (Canis aureus) با تعداد بالا در استان گلستان، در مطالعه حاضر میزان آلودگی شغال­های طلایی، به­عنوان گونه نشانگر سگ­سانان وحشی، به CDV مورد مطالعه قرار گرفت.
روش‎کار: از 64 شغال تلف‌شده در جاده­ها، نمونه سوآب چشمی تهیه و به بافر منتقل شد. با انجام RT-Nested PCR، حضور ویروس در نمونه­ها بررسی گردید.
نتایج: در مطالعه حاضر از 40 قلاده شغال نر و 24 قلاده شغال ماده نمونه­گیری شد. CDV در ۲0 شغال (2/31 درصد) تشخیص داده شد. فراوانی آلودگی به CDV در شغال­های نر (5/32 درصد) و ماده (1/29 درصد) مشابه یکدیگر بود (05/0‌‌P≥‌)‌. همچنین آلودگی به CDV تنها در شغال­های 1 تا 3 سال و در فصول سرد شناسایی گردید.
نتیجه­گیری نهایی: آلودگی بالای شغال­های طلایی در اطراف گرگان به CDV بیانگر آلودگی اکوسیستم حیات­وحش استان گلستان به CDV و احتمال مخزن بودن جمعیت شغال­ها برای حفظ CDV در اکوسیستم وحشی استان گلستان است. با‌توجه‌به عدم دسترسی به جمعیت حیوانات وحشی مستعد ابتلا به ویروس دیستمپر جهت واکسیناسیون و از طرفی حضور بالای سگ­های روستایی در اطراف اکوسیستم وحشی استان گلستان و نقش بسیار مهم آن‌ها در گسترش CDV،  یکی از بهترین راه­ها جهت مهار گسترش ویروس در جمعیت حیوانات وحشی مستعد ابتلا به CDV، انجام واکسیناسیون مناسب جمعیت سگ­های روستایی و ولگرد است.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Molecular Study on the Prevalence of Canine Distemper Virus Infection in Road-Killed Jackals (Canis aureus) in Golestan Province (Gorgan)

نویسندگان [English]

  • Somayeh Namroodi 1
  • Davood Milanloo 2
1 Department of Environmental Sciences, Faculty of Fisheries and Environmental Sciences, Gorgan University of Agricultural Sciences & Natural Resources, Gorgan, Iran
2 Graduated from the Faculty of Fisheries and Environmental Sciences, Gorgan University of Agricultural Sciences & Natural Resources, Gorgan, Iran
چکیده [English]

BACKGROUND: Canine distemper virus (CDV), a morbillivirus with a single-stranded RNA composed of six genes, causes deadly distemper disease in canids. The first hosts of the virus are wild and domestic canids.
OBJECTIVES: Due to the presence of endangered species of felids and canids, such as the Persian leopard (Panthera pardus saxicolor) and Corsac fox (Vulpes corsac) in Golestan Province, Iran obtaining data about the epidemiology of CDV in the susceptible wild mammals' population seems essential. Regarding the presence of many golden jackals (Canis aureus) in Golestan Province, this study surveyed CDV infection in Golden jackals as sentinel species.
METHODS: Eye swabs were provided from 60 road-killed jackals on the highways around Gorgan City and transferred to the buffer. The presence of CDV in the samples was examined by RT-nested PCR.
RESULTS: Forty male and 24 female jackals were sampled. CDV was diagnosed in 20 jackals (31.2%). The prevalence rates of CDV infection in males (32.5%) and females (29.1%) were similar (P≥ 0.05.). CDV infections were only detected in 1-3 years old jackals and in cold seasons.
CONCLUSIONS: CDV infection in 31.2% of sampled golden jackals from Gorgan indicates CDV's presence in north Iran's wild ecosystem. Due to the lack of access to CDV susceptible wild animals for vaccination, the high presence of rural dogs around a wild ecosystem of Golestan Province, and their important role in CDV transmission, proper vaccination of rural and stray dogs is suggested as one of the best ways to control CDV dissemination in the population of wild CDV susceptible animals.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Canids
  • Indicator
  • Morbillivirus
  • Ocular swab
  • Road killed

اصل مقاله

مقدمه

ویروس فاقد دیواره دیستمپر سگ­ها (Canine distemper virus-CDV) از یک RNA تک­رشته­ای دارای بار منفی با شش ژن اصلی که کمترین جهش در ژن کد کنند نوکلئوپروتئین (Nucleoprotein= NP) دیده شده است و به­ همین دلیل در اکثر مطالعات مولکولی جهت شناسایی ویروس، از تکثیر NP ژن استفاده می­شود (1، 2). بعد از آلوده شدن حیوان به ویروس، امکان جداسازی ویروس از خون، مایع مغزی نخاعی، ترشحات تنفسی و گوارشی وجود دارد و یکی از ساده­ترین راه‌های شناسایی ویروس در حیوان مشکوک، تشخیص ویروس در ترشحات چشمی است (3). میزبان اولیه و اصلی ویروس سگ­سانان اهلی و وحشی می‌باشند. با­وجوداین ویروس، طیف وسیعی از سایر حیوانات راسته گوشت­خواران، چون گربه­سانان و پستانداران دریایی و حتی حیوانات غیرگوشت­خوار (گراز) را نیز آلوده ساخته و باعث شده است جمعیت فک­های خزری با خطر انقراض نسل مواجه شوند (4-9). Namroodi و همکاران در سال 2002، با انجام مطالعه سرولوژیک، آلودگی 6/55 درصدی سگ­های روستایی حاشیه ساحلی استان گلستان به CDV را گزارش کردند (10). آلودگی بهCDV  در 13 سگ زیر 1 سال از 19 سگ (دارای علائم بیماری) مورد‌مطالعه از کلینیک­های شهرهای تهران و گرگان، با انجام RT_Nested PCR گزارش شده است (11). Isfahani و همکاران در سال 2017 آلودگی سرولوژیک شغال­ها، روباه‌ها و گرگ­ها را در شمال شرقی ایران (خراسان شمالی، سمنان) به CDV گزارش کردند (12). در استان گلستان خانواده­های زیادی از راسته گوشت­خواران چون گربه­سانان و سگ­سانان که برخی از آن‌ها چون پلنگ ایرانی (Panthera pardus saxicolor) و روباه ترکمنی (Vulpes corsac) با خطر انقراض نسل مواجه می‌باشند، حضور دارند (13، 14). با‌توجه‌به مرگ‌و‌­میر فک خزری در سواحل استان گلستان بر اثر ابتلا به CDV، آلودگی جمعیت سگ­های روستایی منطقه به CDV و حضور شغال­های طلایی (Canis aureus) با تعداد بالا در استان گلستان که ناقل عوامل میکروبی متعددی می­توانند باشند، جهت مطالعه اپیدمیولوژی CDV در مطالعه حاضر شغال­های تلف‌شده بر اثر تصادف در جاده­ها، ازنظر ابتلا به CDV مورد مطالعه قرار گرفتند (10، 15، 16).

مواد و روش کار

در مطالعه حاضر از 64 شغال تلف‌شده بر اثر تصادف در اتوبان­ها (8 تا 10 ساعت بعد از تصادف) اطراف شهرستان گرگان در استان گلستان، ضمن ثبت مشخصاتی چون سن، فصل، محل نمونه­گیری و جنسیت، نمونه سوآب چشمی تهیه شد (17). سوآب­­های استریل به اپندورف­های استریل حاوی بافر نرمال سالین (Phosphate Bufferd Saline) منتقل و تا زمان آزمایشات مولکولی در فریزر 20- درجه سانتی‌گراد نگهداری گردیدند. استخراج RNA با استفاده از کیت استخراج Bioneer صورت گرفت. سنتز cDNA با استفاده از کیت شرکت Vivantis (Malaysia) انجام شد. تکثیر ژن NP توسط کیت شرکت سیناژن، در دو مرحله با استفاده از دو جفت پرایمر (داخلی و خارجی) و با انجام RT_Nested PCR صورت گرفت (11). در انتها ضمن استفاده از مارکر وزن مولکولی DNA یک کیلوبایتی، نمونه به­دست‌آمده با اتیدیوم بروماید رنگ­آمیزی و به ژل آگارز 1 درصد منتقل گردید و بعد از الکتروفورز ژل، با استفاده از اشعه فرابنفش، از ژل عکس­برداری انجام شد.

نتایج

 نتایج حاصل از انجام تست­های مولکولی در مطالعه حاضر بیانگر حضور CDV در 20 نمونه سوآب چشمی از 64 (2/31 درصد) سوآب تهیه‌شده بود (تصویر 1). از 64 شغال مورد‌مطالعه 40 شغال نر و 24 شغال ماده بودند که 5/32 درصد شغال‌های نر و 1/29 درصد شغال‌های ماده آلوده به CDV تشخیص داده شدند و نتایج آزمون آنووا (Anova) بیانگر عدم وجود تفاوت معنی­دار میزان آلودگی دو جنس به CDV بود. بیشترین نمونه مثبت در فصل زمستان (2/88 درصد) و پاییز (25 درصد) و کمترین تعداد در فصل بهار (6 درصد) شناسایی شد. در فصل تابستان هیچ‌یک از شغال‌های مورد‌مطالعه آلوده به CDV نبودند. در مطالعه حاضر شغال­ها به سه گروه سنی 1 تا 3، 3 تا 6 و 6 تا 9 سال تقسیم گردیدند و آلودگی به CDV تنها در گروه سنی 1 تا 3 سال تشخیص داده شد.

بحث

Namroodi و همکاران در سال 2013 آلودگی اکوسیستم استان گلستان به CDV را گزارش کردند و با‌توجه‌به پرسه آزاد سگ­های ولگرد در نواحی روستایی و از طرفی مجاورت نزدیک اکوسیستم حیات­وحش و روستایی در استان گلستان و آب‌­وهوای مناسب نواحی اطراف مناطق مورد‌مطالعه جهت زنده ماندن ویروس، آلودگی 2/31 درصدی شغال­ها در این مناطق قابل‌انتظار بود و این نتایج تأیید‌کننده تماس نزدیک سگ­سانان وحشی و روستایی در مناطق مورد‌مطالعه با یکدیگر است (2، 10، 13، 14). Bellan و همکاران در سال ۲۰۱۲، آلودگی 71 درصدی جمعیت شغال­های پشت­سیاه (Canis mesomelas) را به آنتی­بادی اختصاصی ضد CDV در پارک ملی نامیبیا اعلام کردند (18). Prager و همکاران در سال ۲۰۱۲، نیز آلودگی شغال­های پشت­سیاه (Canis mesomelas) را در نواحی شمالی کنیا از‌طریق مطالعات سرولوژیک به CDV گزارش کرده­اند (19). Isfahani و همکاران در سال 2017، ضمن مطالعه آنتی­بادی ضد دیستمپر سگ­ها در جمعیت سگ­سانان وحشی (روباه معمولی، شغال طلایی و گرگ) خراسان‌جنوبی و سمنان، متوسط آلودگی را در جمعیت مورد‌مطالعه 42 درصد ذکر کردند (12). به‌­دلیل عدم مشابهت روش­های به­کار‌رفته در مطالعات یادشده، نتایج با نتایج مطالعه حاضر قابل‌مقایسه نیست.

مطالعات مولکولی محدودی نیز درمورد میزان آلودگی شغال­ها به CDV صورت گرفته است. در اسرائیل از 92 شغال مورد‌مطالعه 9 مورد برابر با 7/9 درصد از شغال­های مورد‌مطالعه به روش مولکولی آلوده به CDV تشخیص داده شدند (20). بررسی مولکولی ژن نوکلئوپروتئین CDV در نمونه مغز 24 شغال از کشور کرواسی بیانگر عدم وجود ویروس CDVدر شغال­های موردمطالعه بود (21). Yousuf  و همکاران در سال 2014 از 5 شغال به‌ظاهر سالم اطراف کمپ دانشگاه Mymensingh از بنگلادش، نمونه کبد تهیه کردند و با تکثیر ژن نوکلئوپروتئین، ویروس دیستمپر را در دو شغال (40 درصد) تشخیص دادند (22). همان‌گونه که مشاهده می­شود نتایج مطالعه حاضر شباهت زیادی با میزان آلودگی شغال­ها در کشور بنگلادش به CDV دارد. شباهت آب‌و‌هوای استان گلستان با کشور بنگلادش با‌توجه‌به نقش بسیار مهم رطوبت در ماندگاری ویروس در طبیعت می‌تواند یک توضیح مهم بر شباهت نتایج مشاهده‌شده باشد. همچنین ممکن است شباهت آب‌و‌هوای دو منطقه، امکان حضور غذای مناسب برای سگ­سانان وحشی چون شغال با تعداد بالا که موجب حفظ ویروس در جمعیت شغال­ها شود را در هر دو منطقه فراهم کرده باشد و در‌نهایت موجب بروز آلودگی به CDV با فراوانی مشابه در جمعیت شغال­های مورد‌مطالعه در بنگلادش و مطالعه حاضر شده باشد. همان‌طور که در بخش نتایج توضیح داده شد، تفاوت معنی­داری در میزان آلودگی به CDV در شغال­های نر و ماده دیده نشد (05/0P≥). اکثر مطالعات مولکولی و سرولوژیک مشابه چون مطالعه حاضر فاکتور جنسیت را عامل غیرمؤثری در ابتلای سگ­سانان وحشی و اهلی به CDV معرفی کرده­اند (1، 12، 19، 23). آلودگی به CDV در شغال­های ≥‌3 سال به‌طور معنی­داری کمتر از شغال­های جوان­تر از 1 سال بود (05/0P≤). با‌توجه‌به اینکه حساسیت سگ­سانان در سن کمتر از 1 سالگی نسبت به CDV در مقایسه با سگ­سانان مسن­تر از 1 سال بسیار بالاتر می‌باشد، مشاهده چنین نتیجه­ای قابل‌انتظار بود (2). چنان‌که در مطالعات مشابه چون مطالعه Bellan و همکاران در سال 2012 بر شغال­های پشت سیاه و Namroodi و همکاران در سال 2013 بر سگ­های روستایی، نتایج مشابهی بیان شده است (10، 18).

نتیجه­گیری نهایی: نتایج مطالعه حاضر آلودگی اکوسیستم روستایی و وحشی مناطق نمونه­گیری‌شده در استان گلستان را به CDV و خطر بالقوه بروز بیماری دیستمپر سگ­ها را در جمعیت گوشت­خواران وحشی، چون پلنگ ایرانی و روباه ترکمنی که جمعیت آن‌ها با خطر انقراض نسل مواجه شده است، متذکر می­شود. همچنین آلودگی بالای جمعیت شغال­های مورد‌مطالعه که پرجمعیت­ترین گونه سگ­سان وحشی در استان گلستان می‌باشد بیانگر این مطلب است که این گونه می­تواند نقش گونه مخزن را در حفظ CDV در اکوسیستم وحشی مناطق مورد‌مطالعه ایفا کند. انجام مطالعات اپیدمیولوژیک بر جمعیت گربه­سانان و سگ­سانان وحشی که هیچ­گونه اطلاعاتی در‌رابطه‌با وضعیت سلامت آن‌ها و خطراتی که سلامت آن‌ها را تهدید می­کند وجود ندارد، ضروری به­ نظر می­رسد. با‌توجه‌به اثبات نقش مهم سگ­سانان اهلی در انتقال CDV به جمعیت گوشت­خواران وحشی، واکسیناسیون سگ­های اهلی (ولگرد و روستایی) و جلوگیری از افزایش بی­رویه جمعیت سگ­های ولگرد روستایی در نواحی روستایی استان گلستان که اکوسیستم وحشی و روستایی قرابت بالایی با یکدیگر دارند، از‌جمله راهکارهای مناسب جهت جلوگیری از انتشار CDV در جمعیت گوشت­خواران وحشی به ­نظر می­رسد.

سپاسگزاری

مطالعه اخیر با گرنت به شماره 39-400-99 و حمایت دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان صورت گرفته است. با توجه به تهیه نمونه‌های مورد مطالعه از شغال­های تلف شده بر اثر تصادفات جاده­ای، جهت انجام مطالعه حاضر نیاز به دریافت کد اخلاق نبود.

تعارض منافع

بین نویسندگان تعارض در منافع گزارش نشده است.

مراجع

  1. Sykes JE, Vandevelde M. Canine distemper virus infection. In: Greene's Infectious Diseases of the Dog and Cat. 5sted. WB Saunders publisher. Philadelphia, USA. 2021.22:271-288. doi: 10.1016/C2014-0-03934-2
  2. Rendon-Marin S, da Fontoura Budaszewski R, Canal CW, Ruiz-Saenz J. Tropism and molecular pathogenesis of canine distemper virus. Virology J. 2019;16:1-15. doi: 10.1186/s12985-019-1136-6 PMID: 30845967
  3. Abubakar M, Wensman JJ. Emerging Trends in Veterinary Virology. 1sted. Bentham publisher. Amsterdam, Netherlands. 2022.5:61-67.
  4. Duque-Valencia J, Sarute N, Olarte-Castillo XA, Ruíz-Sáenz J. Evolution and interspecies transmission of canine distemper virus—an outlook of the diverse evolutionary landscapes of a multi-host virus. Viruses. 2019;11(7):582-65. doi: 10.3390/v11070582 PMID: 31247987
  5. George AM, Wille M, Wang J, Anderson K, Cohen S, Moselen J, Lee LY, Suen WW, Bingham J, Dalziel AE, Whitney P. A novel and highly divergent canine distemper virus lineage causing distemper in ferrets in Australia. Virology. 2022;576:117-26. doi: 10.1016/j.virol.2022.09.001 PMID: 36228351
  6. Kadam RG, Karikalan M, Siddappa CM, Mahendran K, Srivastava G, Rajak KK, et al. Molecular and pathological screening of canine distemper virus in Asiatic lions, tigers, leopards, snow leopards, clouded leopards, leopard cats, jungle cats, civet cats, fishing cat, and jaguar of different states, India. Infection, Genetics and Evolution. 2022;98:105-134. doi: 10.1016/j.meegid.2022.105211 PMID: 35051653
  7. Kodi H, Putty K, Ganji VK, Bhagyalakshmi B, Reddy YN, Satish K, et al. H gene-based molecular characterization of field isolates of canine distemper virus from cases of canine gastroenteritis. Indian J Anim Res. 2021;55(5):56-72. doi: 10.18805/ijar.B-3989
  8. Weckworth JK, Davis BW, Dubovi E, Fountain‐Jones N, Packer C, Cleaveland S, et al. Cross‐species transmission and evolutionary dynamics of canine distemper virus during a spillover in African lions of Serengeti national park. Molecular Ecol. 2020;29(22):4308-21. doi: 10.1111/mec.15449 PMID: 32306443
  9. Jo WK, Peters M, Kydyrmanov A, van de Bildt MW, Kuiken T, Osterhaus A, et al. The canine morbillivirus strain associated with an epizootic in Caspian seals provides new insights into the evolutionary history of this virus. Viruses. 2019;11(10):894-9. doi: 10.3390/v11100894 PMID: 31557833
  10. Namroodi S, Rostami A, Barin, A, Majidzadeh-Ardebili K. Antibody monitoring to canine distemper virus in unvaccinated rural dogs in the southern coastal region of Caspian Sea. J Vet Res. 2013;68(3):209-215. doi: 10.22059/jvr.2013.35034
  11. Namroodi S, Rostami A, Majidzadeh-Ardebili K, Langroudi AG, Morovvati A. Detection of Arctic and European cluster of canine distemper virus in North and center of Iran. Vet Res Forum. 2015;6(3):199-207. PMID: 26893808
  12. Isfahani MS, Rostami A, Bahonar A, Barin A, Memarian I. Serologic survey for canine distemper virus in free-ranging wild canids in the northeast of Iran. Revue De Med Vet. 2017;168(10-12):247-51. doi: 10.30699/ijmm.15.2.212
  13. Yelghei A, Ghanghermeh A, Roshan G. Spatial and temporal displacements in wet and dry periods in the Southeast of the Caspian Sea: Golestan Province in Iran. J Earth Space Phys. 2020;45:219-35. doi: 10.22059/jesphys.2020.266696.1007046
  14. Yusefi GH, Faizolahi K, Darvish J, Safi K, Brito JC. The species diversity, distribution, and conservation status of the terrestrial mammals of Iran. J Mammalogy. 2019;100(1):55-71. doi: 10.1093/jmammal/gyz002
  15. Namroodi S, Staji H, Sharafi SV. Survey on Salmonella contamination of Golden Jackals by microbiological culture methods and PCR in Golestan and Mazandaran Provinces. J Vet Res. 2017;72(3):269-276. doi: 10.22059/jvr.2017.130431.2342
  16. Simani S. Rabies situation in Iran. J Vet Res. 2003;58(3):275-278. doi: 10.22059/jvr.2017.130431.2342
  17. Bingham J, Purchase GK. Age determination in jackals (Canis adustus Sundevall, 1846, and Canis mesomelas Schreber, 1778; Carnivora: Canidae) with reference to the age structure and breeding patterns of jackal populations in Zimbabwe. African Zoology. 2003;38(1):153-60. doi: 10.1080/15627020.2003.11657203
  18. Bellan SE, Cizauskas CA, Miyen J, Ebersohn K, Küsters M, Prager KC, et al. Black-backed jackal exposure to rabies virus, canine distemper virus, and Bacillus anthracis in Etosha National Park, Namibia. J Wildlife Dis. 2012;48(2):371-81. doi: 10.7589/0090-3558-48.2.371 PMID: 23459924
  19. Prager KC, Mazet JA, Dubovi EJ, Frank LG, Munson L, Wagner AP, Woodroffe R. Rabies virus and canine distemper virus in wild and domestic carnivores in Northern Kenya: Are domestic dogs the reservoir?. Eco Health. 2012;9(4):483-98. doi: 10.1007/s10393-013-0815-9
  20. Lapid R, Motro Y, Craddock H, Khalfin B, King R, Bar-Gal GK, Moran-Gilad J. Fecal microbiota of the synanthropic golden jackal (Canis aureus). Animal Microbiome. 2023;5(1):37-43. doi: 10.1186/s42523-023-00259-3 PMID: 37542305
  21. Prpić J, Lojkić I, Keros T, Krešić N, Jemeršić L. Canine distemper virus infection in the free-living wild canines, the red fox (Vulpes vulpes) and jackal (Canis aureus moreoticus), in Croatia. Pathogens. 2023;12(6):833-46. doi: 10.3390/pathogens12060833 PMID: 37375523
  22. Yousuf MA, Bashu J, Pervin M, Islam MT, Das PM, Khan MA. Identifying diseases of golden jackals of Bangladesh agricultural university campus, Mymensingh, Bangladesh. Bangladesh J Vet Med. 2014;12(2):21-34. doi: 10.3329/bjvm.v12i2.21295
  23. Tavakoli Zaniani A, Mokhtari A, Esmailnejad A. Molecular and immunological investigation of canine distemper virus (CDV) and its co-infection with canine parainfluenza virus type 2. Iran J Med Microbiol. 2021;15(2):212-226. doi: 10.30699/ijmm.15.2.212
مجله تحقیقات دامپزشکی (Journal of Veterinary Research)
دوره 79، شماره 2
خرداد 1403
صفحه 111-116

فایل ها

هم رسانی

ارجاع به این مقاله

آمار