بررسی میزان آلودگی به باکتری استافیلوکوکوس اورئوس واجد ژن بتالاکتاماز در گوشت چرخ‌کرده‌های بسته‌بندی شده در شهر سمنان و تاثیر عصاره های متانولی فلفل قرمز (Capsicum frutescens) و پیازقرمز (Allium cepa) بر ضد آن‌ها

نوع مقاله: بهداشت مواد غذایی

نویسندگان

1 گروه بهداشت مواد غذایی، دانشکده دامپزشکی دانشگاه سمنان، سمنان، ایران

2 گروه پاتوبیولوژی، دانشکده دامپزشکی دانشگاه سمنان، سمنان، ایران

3 دانش آموخته دانشکده دامپزشکی دانشگاه سمنان، سمنان، ایران

چکیده

زمینۀ مطالعه: : یکی از مهم­ترین میکروارگانیسم­های بیماری­زا در فرآورده­های گوشتی به ویژه آن‌هایی که طی تولید مکررا با دست تماس دارند، استافیلوکوکوس اورئوس می­ باشد. برای درمان اغلب عفونت­های ناشی از استافیلوکوکوس اورئوس از داروهای بتالاکتام به خصوص نسل­های جدید سفالوسپورین­ها استفاده می­ شود، اما تولید آنزیم بتالاکتاماز توسط برخی از سویه­ ها موجب ناموفق بودن درمان عفونت­ های وابسته به این ارگانیسم شده است.
هدف: تحقیق حاضر با هدف ارزیابی میزان آلودگی و مقایسه اثر ضد میکروبی عصاره­های متانولی فلفل­ قرمز و پیاز­قرمز بر استافیلوکوکوس اورئوس­های واجد ژن بتالاکتاماز جدا شده از گوشت چرخ­ کرده در شهر سمنان انجام شد.
روش‌کار: بدین منظور نمونه­برداری از 30 مرکز توزیع و عرضه گوشت بسته­بندی شده در شهر سمنان تحت شرایط بهداشتی انجام شد و تمام نمونه­ها از نظر حضور استافیلوکوکوس اورئوس واجد ژن بتالاکتاماز مورد آزمایش جداسازی با روش­های بیوشیمیایی و تایید مولکولی با تست PCR قرار گرفتند. همچنین اثر ضد باکتریایی عصاره‌های فلفل­قرمز و پیاز­قرمز بر جدایه­های مذکور با تست­های حداقل اثر مهاری (MIC)، حداقل اثر کشندگی (MBC)، انتشار چاهک و منحنی رشد باکتری ارزیابی شد.
نتایج: نتایج نشان داد که 20 درصد نمونه­ها آلوده به باکتری استافیلوکوکوس اورئوس واجد ژن بتالاکتاماز بودند. عصاره ­های فلفل­قرمز و پیاز­قرمز اثر ضد باکتریایی خوبی را بر ضد این جدایه­ ها نشان دادند و در تمام تست­ها عصاره فلفل­قرمز نسبت به پیاز­قرمز موثرتر بود.
نتیجه‌گیری نهایی: با اثبات اثر ضد میکروبی قوی­تر فلفل­ قرمز توصیه می­ شود در غذاهایی مانند انواع کباب که از گوشت چرخ ­کرده تهیه می­شوند حتما در کنار پیاز از فلفل نیز به میزان مناسب استفاده شود.

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Assessment of Prevalence and Molecular Characterization of Beta-lactams Resistant Staphylococcus aureus Bacteria Isolated From Raw Minced Beef in Semnan and Effect of Red Pepper (Capsicum frutescens) and Red Onion (Allium cepa) Extracts Against Them

نویسندگان [English]

  • Ashkan Jebelli Javan 1
  • Hamid Staji 2
  • Najmeh Rezaei 3
  • Ghazal Shemshadi 3
  • Soghra Birgani Farhani 2
  • Mansooreh Kanani 1
1 Department of Food Hygiene, Faculty of Veterinary Medicine, Semnan University, Semnan, Iran
2 Department of Pathobiology, Faculty of Veterinary Medicine, Semnan University, Semnan, Iran
3 Graduated from the Faculty of Veterinary Medicine, Semnan University, Semnan, Iran
چکیده [English]

BACKGROUND: Staphylococcus aureus is one of the most important pathogenic microorganisms in meat products, especially those that are repeatedly handled by hand in the production process. Beta-lactam drugs, especially new generations of Cephalosporins, are used for treatment of most infections that are caused by Staphylococcus aureus. But the production of beta-lactamase enzyme by some strains has led to the failure for treating the infections that are associated with this organism.
OBJECTIVES: The present study was conducted to evaluate the prevalence and comparison of the antimicrobial effect of methanolic extracts of red pepper and red onion on Staphylococcus aureus with beta-lactamase gene that was isolated from minced meat in Semnan city.
METHODS: For this reason, sampling from 30 distribution and supply centers of packaged meat in Semnan city was performed in hygienic conditions and all of the samples were tested for presence of Staphylococcus aureus with beta-lactamase gene by biochemical methods and molecular confirmation by PCR assay. Also, the antibacterial effect of red pepper and red onion extracts on these isolates was evaluated by minimum inhibitory concentration (MIC), minimum bacterial concentration (MBC), well distribution and bacterial growth curve tests.
RESULTS: The results showed that 16.6 percent of samples were contaminated with Staphylococcus aureus with beta-lactamase gene. Red pepper and red onion extracts had good antibacterial effects on these isolates and in all the tests, the red pepper extract was more effective than the red onion extract.
CONCLUSIONS: By proving stronger antimicrobial effect of red pepper, it is recommended to use pepper in sufficient amounts along with onion in foods that are made from minced meat like all kinds of Kebab.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Staphylococcus aureus
  • Beta-lactamase
  • Extract
  • Red pepper
  • Red onion
  • Mixed meat

مقدمه

 

در طول دهه گذشته وقوع بیماری­های میکروبی ناشی از مواد غذایی نه تنها در کشورهای در حال توسعه دارای فقر بهداشتی، بلکه در کشورهای توسعه یافته با استاندارد بالای بهداشتی نیز رو به افزایش بوده است (17).

یکی از مهم­ترین میکروارگانیسم­های بیماری­زا (پاتوژن) در فرآورده­های گوشتی به ویژه آن‌هایی که طی تولید مکررا با دست تماس دارند، استافیلوکوکوس اورئوس (عامل مسمومیت غذایی استافیلوکوکال) می­باشد و در حال حاضر سلامت عمومی را در سراسر جهان به خطر انداخته است. در انسان، این باکتری در قسمت قدامی بینی بزرگسالان وجود دارد و در 20 تا 30 درصد از جمعیت انسانی به صورت دائم و پایدار و در 60 درصد افراد به صورت متناوب دیده می­شود. لذا افرادی که در مراکز تهیه، عمل­آوری و توزیع غذا فعالیت دارند، در صورت عدم رعایت مسائل بهداشتی قادرند باکتری را به غذا انتقال دهند (5).

باکتری استافیلوکوکوس اورئوس دارای توکسین­های مختلفی مانند لوکوسیدین، همولیزین و انتروتوکسین است، که در بیماری‌های غذازاد، انتروتوکسین از اهمیت زیادی برخوردار بوده و مصرف مواد غذایی آلوده به این توکسین موجب بروز مسمومیت غذایی می­گردد (4). از دلایل شیوع بالای مسمومیت استافیلوکوکی می­توان به وجود باکتری در پوست و مخاط کارکنان، مقاومت و رشد باکتری در محیط‌های قندی نمکی و از همه مهم­تر تولید انتروتوکسین مقاوم به حرارت اشاره کرد (18،‌ 15).

برای درمان اغلب عفونت­های ناشی از استافیلوکوکوس اورئوس از داروهای بتالاکتام به خصوص نسل­های جدید سفالوسپورین­ها استفاده می­شود، اما افزایش سریع مقاومت به این داروها موجب ناموفق بودن درمان عفونت­های وابسته به این ارگانیسم شده است. اصلی­ترین مکانیسم مقاومت به داروهای بتالاکتام در استافیلوکوکوس­ها تولید آنزیم­های بتالاکتاماز و یا تغییر پروتئین­های دیواره (Penicillin Binding Proteins, PBPs) می­باشد که تمایل کاهش­یافته آن‌ها به دارو منجر به مقاومت وسیعی نسبت به پنی‌سیلین­های نیمه سنتزی، سفالوسپورین­ها و کارباپنم­ها می­شود. بتالاکتامازها به طور انتخابی حلقه بتالاکتام را باز می­کنند به نحوی که ساختار تغییر­یافته دارو نمی­تواند اتصال موثری با PBSها برقرار نماید و در نتیجه سنتز سلولی ادامه می­یابد (22) همبستگی بین مقاومت به پنی­سیلین در ایزوله­های بالینی استافیلوکوکوس اورئوس و تولید بتالاکتاماز، اولین بار در سال 1944 گزارش شد. طبق آمار، سویه­های مقاوم باکتری از میزان 5 درصد در سال 1946، به 50 درصد در سال 1950 و به بیش از 90 درصد تا سال 2000، رسیده است (7).

دو مکانیسم مقاومت اولیه در برابر بتالاکتام­ها در گونه‌های استافیلوکوکوس قابل توجه است: بیان آنزیم­های بتالاکتاماز کدگذاری شده توسط ژن blaZ و تولید پروتئین­های اتصال دهنده پنی­سیلین 2a که توسط ژن MecA کدگذاری شده است. شیوع مقاومت پنی‌سیلین در بیماری­های جانوری ناشی از استافیلوکوکوس اغلب به دلیل ژن blaZ است. ژن blaZ بخشی از اپران سه قسمتی bla است. اپران bla شامل blaZ، blaI و blaR1 است (10).

تست­های مختلفی برای ارزیابی محصولات بتالاکتاماز در استافیلوکوکوس­ها می­تواند انجام شود. یک روش کیفی برای جداسازی بتالاکتاماز، استفاده از دیسک­های Nitrocefin است. در این روش از سوسپانسیون­های باکتریایی در سرم فیزیولوژی بر روی این دیسک­ها استفاده می­شود و تغییر رنگ دیسک مورد بررسی قرار می­گیرد. یک روش دیگر، استفاده از تست میکروبیولوژیک clover leaf است. در این تست، بر روی محیط آگار مولر هینتون، یک سویه آکسفورد استافیلوکوکوس اورئوس، به عنوان شاخص، و از دیسک‌های حاوی یک میکروگرم بنزیل پنی­سیلین استفاده می­شود (23).

با توجه به اینکه این تست­های فنوتیپی حساسیت کمتر از 72 درصد دارند، ردیابی blaZ با استفاده از روش PCR، به عنوان gold standard توصیه می­شود (10).

نتایج مطالعات انجام شده بر روی آلودگی باکتریایی غذاهای مصرفی در برخی از دانشگاه­ها نشان داد که کباب­کوبیده و ماهی از نظر شمارش کلی باکتری­ها آلوده­ترین نوع غذاها بوده­اند و 6/55 درصد نمونه­ها دارای آلودگی استافیلوکوکوس اورئوس بوده­اند و همچنین آلودگی به استافیلوکوکوس اورئوس فقط در نمونه­های مربوط به کباب­کوبیده وجود داشته است (26).

از زمان کشف داروهای شیمیایی و ترکیبات ضد میکروبی، گرچه کنترل عفونت­های غذایی امکان­پذیر گردیده، ولی با این همه، برخی باکتری­ها به ترکیبات فوق مقاوم هستند و علاوه بر این نگرانی‌هایی در خصوص ایمنی و پتانسیل اثر افزودنی­های مصنوعی و عوارض جانبی نگهدارنده­های شیمیایی بر سلامت مصرف­کنندگان مطرح شده که معطوف شدن توجهات به بحث جایگزینی آن‌ها با ترکیبات ضد میکروبی طبیعی را در پی داشته است. در این میان، توجه تولیدکنندگان و مصرف­کنندگان به استفاده از ترکیبات گیاهی معطوف شده که خواص ضد میکروبی ترکیبات فوق، مورد مطالعه قرار گرفته و اثرشان علیه طیف وسیعی از باکتری­ها، مخمرها و قارچ­ها به اثبات رسیده است (19).

پیاز و فلفل از مهم­ترین و پرکاربرد­ترین افزودنی­های گیاهی در مواد غذایی تهیه شده از گوشت چرخ کرده مانند کباب کوبیده می‌باشند. پیاز نوعی گیاه غده­ای گوشتی زیر زمینی از خانواده لاله با نام علمی Allium cepa است. پیاز دارای بخش هوایی و بخش ریشه خوراکی است. بو و مزه پیاز مربوط به ترکیب محیط و ژنتیک آن است. بوی پیاز مربوط به مواد گوگردی فراری است که در هنگام تقطیر در حرارت معمولی اتاق تجزیه می­گردند. فلاوونوئیدهای پیاز ترکیبات شیمیایی هستند که در برابر میکروارگانیسم‌ها فعال می‌شوند و در محیط آزمایشگاه، در برابر رشد میکروارگانیسم­ها اثر آنتی باکتریال از خود نشان می­دهند (31).

فلفل قرمز از جمله گیاهانی است که در طب سنتی در درمان عفونت­های چرکی استفاده می­شوند. فلفل گیاهی است علفی و دارای ساقه بی کرک که از تیره Piperaceae است. برخی از ترکیبات ضد میکروبی استخراج شده از آن عبارتند از: کاپسانتین، ترپینر، بتاپینن، آلفاپینن، لینالئول و ترپینئول (33).

بنابراین تحقیق حاضر با هدف بررسی و مقایسه اثر ضد میکروبی عصاره­های متانولی فلفل­قرمز و پیاز­قرمز بر استافیلوکوکوس اورئوس واجد ژن بتالاکتاماز جدا شده از گوشت چرخ­کرده، انجام شد.

مواد و روش‌کار

تهیه عصاره الکلی: پس از تهیه میوه فلفل­قرمز و پیاز­قرمز از فروشگاه­های محلی و شناسایی دقیق آن ناخالصی­های احتمالی موجود جدا گردید، قسمت­های خوراکی گیاه خرد و در سایه خشک گردید و پس از آسیاب کردن بصورت پودر درآمد و سپس با نسبت 1 به 5 با متانول 70 درصد در آب مقطر (v/v) به صورت سوسپانسیون درآورده شدند و در محیط آزمایشگاه نگه داشته شدند و پس از 24 ساعت مخلوط حلال و گیاه از هم جدا شدند و به وسیله کاغذ­های صافی بزرگ (واتمن شماره 41) و کوچک (واتمن شماره 1)، فیلتراسیون دقیق انجام شد تا عصاره خالص حاصل شود. عصاره خالص در دستگاه تبخیر کننده دوار تحت خلا (روتاری) ( ساخت آلمان، شرکت IKA) قرار گرفت و در دمای 45 درجه سانتیگراد حلال آن به مدت 1 ساعت به آرامی تبخیر و عصاره غلیظ شده به دست آمد (20).

نمونه­برداری و جداسازی استافیلوکوکوس: نمونه­برداری از 30 مرکز توزیع و عرضه گوشت بسته­بندی شده در شهر سمنان تحت شرایط بهداشتی و به صورت کاملاً تصادفی انجام شد و نمونه­ها در بسته‌های 500 گرمی در کنار یخ به آزمایشگاه بهداشت مواد غذایی منتقل شدند. برای جداسازی استافیلوکوکوس اورئوس ابتدا 25 گرم از نمونه به 225 سی­سی پپتون واتر بعنوان غنی کننده اولیه افزوده شد و پس از مخلوط کردن کامل، 24 ساعت در 37 درجه سانتیگراد گرمخانه گذاری شد. 1/0 سی سی از هر نمونه در محیط کشت اختصاصی استافیلوکوکوس اورئوس (آگار برد پارکر) کشت داده شد و به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد گرمخانه گذاری گردید (30). تایید بیوشیمیایی کلنی‌های سیاه با هاله شفاف اطرافی به وسیله آزمون­های تولید کواگولاز و نوکلئاز مقاوم به حرارت و کاتالاز صورت گرفت (2). پس از تایید بیوشیمیایی کلنی­های استافیلوکوکوس اورئوس با روش PCR از نظر جنس و گونه و حضور ژن بتالاکتاماز مورد بررسی و تایید قرار گرفتند. جدایه­های تایید شده به مدت 18 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد در محیط آبگوشت قلب و مغز (BHI) کشت داده شد. سپس کشت مجدد از کشت اول داده شد و به مدت 18 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد نگهداری شد. از کشت دوم برای تهیه استوک به نسبت 1 به 5 با گلیسرین استریل مخلوط و در حجم­های 100 میکرولیتری در لوله­های اپندورف استریل در 20- درجه سانتیگراد نگهداری شد (16).

استخراج اسیدهای نوکلئیک:جهت استخراج DNA از جدایه­های ذخیره شده S. aureusابتدا نمونه­ها از یخچال خارج شده و بمدت 24 ساعت در محیط لوریا برتانی آگار (LB) در دمای 37 درجه سانتیگراد کشت شدند. سپس از پرگنه­های رشد یافته برداشت کرده و به میکروتیوب­های حاوی 25 میکرولیتر NaOH نیم نرمال افزوده شد تا شیرابه‌ای یکنواخت بدست آید. پس از گذشت 30 دقیقه، 25 میکرولیتر تریس یک مولار به سوسپانسیون فوق اضافه گردید تا عمل هضم باکتری­ها توسط سود متوقف شده و محلولی با pH نهایی 5/7 تهیه شود. بلافاصله با افزودن 450 میکرولیتر آب مقطر استریل به مجموعه حجم محلول به 500 میکرولیتر رسیده و رقت نهایی از عصاره DNA جهت انجام آزمون PCR تهیه گردید.

انجام آزمون PCR جهت تایید مولکولی S. aureus و ردیابی ژنblaZ : پس از انجام مراحل استخراج DNA از سوش­های استافیلوکوکوس آرئوس مورد مطالعه، واکنش زنجیره­ای پلی مراز مطابق پروتکل ارائه شده توسط Trung و همکاران در سال 2015 با استفاده از یک جفت پرایمر اختصاصی توالی 16SrRNA گونه S.aureus، و جهت ردیابی ژن بتالاکتاماز blaZ از پرایمرها و پروتکل ارائه شده توسط Haveri و همکاران در سال 2005 درون دستگاه ترموسایکلر XP (BIOER tech. China)­­ در 35 سیکل و تحت شرایط دمایی زیر انجام شد: دناتوراسیون اولیه 3 دقیقه در 94 درجه سانتیگراد ، دناتوراسیون 1 دقیقه در 94 درجه سانتیگراد، اتصال 40 ثانیه در 3/57 درجه سانتیگراد، طویل­سازی 40 ثانیه در 72 درجه سانتیگراد و طویل­سازی نهایی 4 دقیقه در 72 درجه سانتیگراد انجام پذیرفت (27‌، 13). توالی پرایمرهای مورد استفاده در این مطالعه در جدول1 آمده است. مخلوط واکنش در حجم نهایی 25 میکرولیتر شامل: 3 میکرولیتر DNA استخراج شده، 5/12 میکرولیتر مستر میکس، 1 میکرولیتر از پرایمرها (جدول 1)، 5/7 میکرولیتر آب مقطر استریل در یک میکروتیوب 2/0 میلی­لیتری تهیه شد.

برای قرائت نتایجPCR ، محصولات PCR روی ژل آگارز 5/1 درصد الکتروفورز گردید. شاهد مثبت و منفی در تمام واکنش­های PCR مورد استفاده قرار گرفت. به عنوان شاهد مثبت گونه استافیلوکوکوس آرئوس از سویه استاندارد 29213 و به عنوان شاهد منفی از گونه اشریشیاکلی استفاده شد. بدلیل عدم وجود سویه استاندارد واجد ژن blaZ جهت استفاده در مطالعه حاضر، محصولات تکثیر شده در آزمون مورد نظر جهت تعیین توالی به شرکت سیناکلون ارسال شده و نتایج اخذ شده پس از انجام Nucleotide BLAST مشخص نمود که توالی مربوط به محصولات تکثیر شده دقیقاً متعلق به ژن blaZ می‌باشند. بعلاوه صحت نتایج PCR با استفاده از سوش فاقد مقاومت فنوتیپی در تست آنتی­بیوگرام علیه آنتی­بیوتیک­های بتالاکتام از لحاظ وجود باندهای غیر­اختصاصی کنترل گردید. در گوده اول ژل نیز مارکر bp-plus100 استفاده شد (تصویر 1). برای رنگ­آمیزی ژل از رنگ Ethidium Bromide  استفاده شده و  زیر دستگاه UV نتایج بررسی شد

اثر ضد میکروبی عصاره‌ها بر جدایه‌های استافیلوکوکوس اورئوس-تهیه میزان تلقیح باکتری: جهت تهیه میزان تلقیح باکتری از کشت استوک گلیسیرینه به داخل محیط آبگوشت BHI برده و در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 18 ساعت گرمخانه گذاری شد. سپس از کشت اول کشت مجددی داده شد و در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 18 ساعت گرمخانه گذاری شد. از کشت دوم مقادیر مختلفی به داخل لوله کووتی که حاوی 4 میلی­لیتر آبگوشت BHI استریل بود، منتقل شد تا جذب نوری 1/0 در طول موج 600 نانومتر به دست آید. سپس با انتقال 1 میلی­لیتر از سوسپانسیون باکتریایی داخل کووت، به لوله حاوی 9 میلی­لیتر آب پپتونه 1/0 درصد رقت­های متوالی تا 10 به نمای منفی شش، از طریق انتقال 100 میکرولیتر از هر رقت به پلیت­های حاوی BHI آگار از رقت­های تهیه شده، کشت داده شد. پلیت­ها به مدت 24 ساعت در دمای  35 درجه سانتیگراد گرمخانه گذاری شد و پس از این مدت، تعداد باکتری شمارش شد و از این طریق میانگین تعداد باکتری درکووت حاوی سوسپانسیون باکتری با جذب نوری معادل 1/0 با دو بار تکرار محاسبه شد. با مشخص شدن این عدد، هرگاه که سوسپانسیون باکتریایی با جذب نوری 1/0 تهیه شود، تعداد باکتری در آن معادل عدد محاسبه شده بوده و می­توان از این سوسپانسیون غلظت­های دلخواه را تهیه نمود. البته در هر مورد تعداد دقیق باکتری تلقیح شده از طریق کشت هم زمان باکتری و شمارش تعداد کلونی محاسبه شد (11).

روش انتشار از چاهک در آگار (agar well diffusion): در این روش از محیط آگار مولر هینتون استفاده گردید (28). بدین ترتیب که سواب های پنبه ای استریل، درون سوسپانسیون باکتریایی با غلظت 106 CFU در هر میلی لیتر غوطه ور شدند و درون لوله در قسمت بالای سطح مایع، به دیواره لوله فشرده شدند. سپس سواب به سرعت در تمام سطح پلیت حرکت داده شد تا تلقیح به خوبی انجام شود. در هر پلیت شش چاهک با فواصل یکسان به قطر 6 میلی متر، یکی در مرکز و پنج تا در اطراف ساخته شد، به گونه­ای که 2 میلی متر از لبه پلیت فاصله داشت. 5 تا از چاهک­ها به صورت آسپتیک با 50 میکرولیتر از غلظت­های مختلف هر عصاره (100، 200، 300، 400 و 500 میلی­گرم در میلی­لیتر در BHI براث حاوی 5 درصد DMSO) پر شدند. یکی از چاهک­ها نیز به عنوان کنترل با 50 میکرولیتر محیط استریل BHI براث حاوی 5 درصد DMSO پر شد. پلیت­ها به مدت 2 ساعت در دمای 4 درجه سانتیگراد قرار گرفتند تا عصاره در آگار پخش شود و سپس به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد گرمخانه گذاری شدند. در نهایت محدوده ممانعت بر حسب میلی­متر اندازه­گیری شد. آزمایش با سه بار تکرار انجام شد و نتایج به صورت میانگین ± انحراف معیار گزارش گردید (1).

 تعیین حداقل غلظت بازدارنده رشد (MIC) به روش میکرودایلوشن: در مطالعه حاضر، جهت تعیین حداقل غلظت بازدارنده رشد به روش میکرودایلوشن از پلیت 96 خانه با چاهک ته گرد و با حجم 300 میکرولیتر استفاده گردید. غلظت­های متوالی از عصاره­ها در آبگوشت BHI حاوی 5 درصد DMSO تهیه شد. سپس 200 میکرو­لیتر از هر کدام از غلظت­ها به هر کدام از پلیت­های 96 خانه انتقال داده شد و تا 30 میکرولیتر از سوسپانسیون هر باکتری نیز اضافه شد (با غلظت نهایی 105 x 5 CFU در هر میلی­لیتر باکتری در هر چاهک)، که با تهیه رقت­های متوالی از سوسپانسیون باکتری و کشت در پلیت و شمارش تعداد کلونی تایید گردید. محتویات هر چاهک به مدت 2 دقیقه توسط Plate Reader مجهز به شیکر مخلوط شد. سپس جذب نوری با استفاده از Plate Reader در زمان صفر و با طول موج 600 نانومتر خوانده شد. پلیت­ها به مدت 24 ساعت در دمای 35 درجه سانتیگراد گرمخانه گذاری شدند و بعد از اتمام گرمخانه گذاری کدورت یا عدم کدورت در چاهک­ها به صورت چشمی مشاهده گردید و با جذب نوری خوانده شده بعد از گرمخانه گذاری توسط Plate Reader تایید شد. روش کار به این صورت بود که افزایش جذب نوری به میزان بزرگتر یا مساوی 1/0 نسبت به زمان صفر به معنای رشد باکتری و ایجاد کدورت و اولین غلظت از عصاره­ها که فاقد کدورت بودند به منزله حداقل غلظت بازدارنده رشد (MIC) در نظر گرفته شدند (24 ، 16).

MBC: تعیین حداقل غلظت کشندگی باکتری (باکتری کشی): برای تعیین MBC، 20 میکرولیتر از رقت­های متوالی عصاره و سوسپانسیون باکتری که در تست MIC فاقد کدورت بودند، در محیط تازه نوترینت آگار به صورت خطی کشت داده شد و به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد گرمخانه گذاری شد. کمترین غلظتی که فاقد رشد در محیط نوترینت آگار بود، به عنوان MBC گزارش شد (1).

بررسی اثر عصاره­های پیاز و فلفل بر نمودار رشد باکتری: در این مرحله بر اساس نتایج حاصل از تعیین حداقل غلظت بازدارنده رشد عصاره­ها (جدول 4) اثر غلظت­های تحت بازدارنده عصاره­های پیاز و فلفل به تنهایی و به صورت توام با هم روی رشد یکی از ایزوله­های تایید شده در طی 24 ساعت مورد ارزیابی قرار گرفت. غلظت­های مورد استفاده عبارت بودند از عصاره متانولی فلفل صفر و 5/7 میلی گرم بر میلی­لیتر و عصاره متانولی پیاز 0 و 5/12 میلی­گرم بر میلی­لیتر. مجموع حالات مورد استفاده در جدول 2 آمده است. 10 میلی­لیتر از محلول­های تهیه شده (در غلظت­های مختلف) در لوله­ها توزیع شد و سپس 100 میکرولیتر سوسپانسیون باکتری (با غلظت نهایی 105 x 5 CFU در میلی­لیتر) به هر 4 لوله اضافه گردید. لوله­ها در دمای 35 درجه سانتیگراد گرمخانه گذاری شدند و در ساعت­های صفر، 1، 2، 4، 6، 8، 10، 12، 24 رقت­های مورد مطالعه از هر 4 لوله در زمآن‌های فوق تهیه شد و در پلیت آگار BHI به صورت سه تایی کشت داده شد و بعد از گرمخانه گذاری به مدت 24 ساعت در دمای 35 درجه سانتیگراد شمارش تعداد کلونی انجام شد و تعداد باکتری­ها در ساعات مورد نظر بر حسب لگاریتم CFU در هر میلی­لیتر (log CFU/ml) محاسبه شد.

نمودارهای مربوط به منحنی رشد باکتری با نرم افزار Graphpad prism 4 ترسیم شد و کلیه تحلیل­های آماری بین لگاریتم تعداد باکتری­ها در ساعات مختلف و همچنین شیب خط منحنی­های رشد با استفاده از نرم­افزار SPSS 16 صورت گرفت. جهت مقایسه داده­ها از تست One-way ANOVA همراه تست تکمیلی توکی و همچنین آنالیز ارزیابی­های مکرر (Repeated measure) برای بررسی روند رشد استفاده شد و اختلاف میانگین داده­ها در سطح 5 درصد از لحاظ آماری، معنی­دار تلقی گردید.

نتایج

میزان آلودگی نمونه­ها:میزان آلودگی به باکتری استافیلوکوکوس اورئوس و تایید ملکولی باکتری و ژن بتالاکتاماز جدایه­ها در نمونه­های گوشت چرخ­کرده به ترتیب در جدول 2 و تصویر  1 نمایش داده شده است. همان­گونه که مشاهده می­شود از 22 نمونه از گوشت­های چرخ­کرده (3/73 درصد) استافیلوکوکوس اورئوس جدا گردید که تمام جدایه­ها با تست PCR نیز تایید شدند (تصویر 1). ردیابی ژن blaZ  نیز نشان داد که 5 نمونه از جدایه­های استافیلوکوکوس اورئوس (7/22 درصد از نمونه­های آلوده و 6/16 درصد از کل نمونه­ها) حاوی ژن بتالاکتاماز بودند (تصویر 1).

اثر ضد میکروبی عصاره­ها: بر اساس نتایج این پژوهش، فعالیت ضد باکتریایی عصاره­های پیاز و فلفل­قرمز بر روی 5 جدایه استافیلوکوکوس اورئوس حاوی ژن بتالاکتاماز در جدول 4 آمده است. همان گونه که مشاهده می­گردد در تمامی آزمایش­ها و بر ضد تمام جدایه­های استافیلوکوکوس اورئوس عصاره فلفل­قرمز اثر مهاری قوی­تری دارد که این برتری در ارتباط با آزمایش انتشار چاهک از نظر آماری نیز معنادار می­باشد (05/0>P).

 

 

 

جدول 1. مشخصات پرایمرهای استفاده شده جهت ردیابی ژن 16s rRNA و blaZ.

ژن هدف

اندازه­ی محصول

توالی پرایمر

نام پرایمر

16S rRNA

515 bp

5'- AAGGGCGAAATAGAAGTGCCGG-3'

S. aureus.F

515bp

5´- ATGGTCGGTTCCTTAGAAAACAAACTTG-3'

S. aureus.R

blaZ

579bp

5'- AAGAGATTTGCCTATCCTTC-3'

blaZ. F

 

579bp

5'- GCTTGACCACTTTTATCAGC-3'

blaZ. R

 

جدول 2. مجموع حالات مورد استفاده در بررسی اثر غلظت­های مختلف عصاره­های فلفل قرمز و پیاز قرمز روی نمودار رشد باکتری.

 

حالت اول

حالت دوم

حالت سوم

حالت چهارم

غلظت عصاره پیاز (میلی گرم در میلی لیتر)

صفر

5/12

صفر

5/12

غلظت عصاره فلفل ( میلی گرم در میلی لیتر)

صفر

صفر

5/7

5/7

جدول 3. تعداد نمونه­های آلوده به  استافیلوکوکوس اورئوس.

تعداد نمونه­ها

30

تعداد نمونه­های آلوده به استافیلوکوکوس اورئوس

22 (3/73 درصد)

تعداد نمونه­های آلوده به استافیلوکوکوس اورئوس واجد ژن بتالاکتاماز

5 (6/16 درصد)

 

جدول 4. فعالیت ضد میکروبی عصاره­های فلفل قرمز و پیاز قرمز بر روی جدایه­های استافیلوکوکوس اورئوس حاوی ژن بتالاکتاماز.

 

عصاره پیاز­قرمز

عصاره فلفل­قرمز

جدایه ها

MBC (mg/ml)

MIC (mg/ml)

IZ (mm)

MBCc(mg/ml)

MICb (mg/ml)

IZa (mm)

1

35

25

6/0± 8B

20

15

6/0± 15A*

2

40

25

5/0± 7B

25

15

9/0± 16A

3

40

25

4/0± 5B

20

15

0/1± 15A

4

35

25

6/0± 7B

20

10

8/0± 17A

5

40

25

3/0± 6B

25

15

5/0± 15A

 

a (Inhibition Zone) : میانگین ±انحراف معیار قطر هاله مهاری به میلی­متر، b MIC: حداقل غلظت مهاری (میلی­گرم بر میلی­لیتر)، c MBC : حداقل غلظت کشندگی (میلی­گرم بر میلی­لیتر)، * حروف غیر مشابه در ستون­های مربوط به IZ نشان دهنده تفاوت معنادار آماری (05/0 >P) بین دو عصاره می­باشند.

 

 تصویر 1. نتایج حاصل از الکتروفورز محصولات PCR بر روی ژل آگارز. M: مارکر به اندازه 100 باز، :B1 شاهد منفی (جدایه اشریشیاکلی) مربوط به آزمون تایید استافیلوکوکوس آرئوس، Sa+: شاهد مثبت استافیلوکوکوس آرئوس (29213)، 1-5: نمونه­های مثبت تشخیص داده شده به عنوان S. aureus، B2: شاهد منفی جهت ردیابی blaZ، Bla+: نمونه شاهد مثبت blaZ (تعیین توالی شده مطابق جدول 2)، 6-10 : نمونه­های مثبت از لحاظ حضور ژن blaZ.

نمودار1. منحنی رشد و شیب خطی رشد (روند افزایشی) باکتری استافیلوکوکوس اورئوس در حضور کنترل، عصاره فلفل به تنهایی، عصاره پیاز به تنهایی و ترکیب عصاره­های پیاز و فلفل (O: پیاز، P: فلفل).

 بررسی اثر عصاره­های پیاز و فلفل بر نمودار رشد باکتری: نمودار 1 منحنی­های رشد و همچنین شیب خطی (روند افزایشی) جدایه استافیلوکوکوس اورئوس حاوی ژن بتالاکتاماز را در حضور  عصاره­های هیدروالکلی پیازقرمز و فلفل­قرمز نشان می­دهند. تحلیل آماری روی منحنی رشد باکتری در نمودار 1 نشان داد که از ساعت 2 گرمخانه گذاری در تمامی ساعات میزان باکتری در گروه کنترل و گروه حاوی عصاره پیاز­قرمز بیشتر از گروه­های عصاره فلفل­قرمز و گروه ترکیبی بود (001/0>P) و بین دو گروه کنترل و عصاره پیاز و همچنین بین دو گروه عصاره فلفل و گروه ترکیبی اختلاف معنادار دیده نشد (05/0<P). مقایسه و تحلیل آماری لگاریتم تعداد باکتری­ها در هر گروه و بررسی افزایش معنادار در تعداد باکتری­ها (001/0>P) نشان داد که دوره فاز تاخیر در گروه­های کنترل، عصاره پیاز، عصاره فلفل و ترکیب پیاز و فلفل به ترتیب 1، 2، 4 و 4 ساعت بود. مقایسه شیب خطی منحنی­های رشد باکتری استافیلوکوکوس اورئوس در حضور عصاره­های پیاز و فلفل نیز نشان داد که بین روند افزایشی تعداد باکتری در دو گروه کنترل (با شیب 02/0±17/0) و پیاز به تنهایی (با شیب 02/0±17/0) و همچنین بین دو گروه فلفل به تنهایی (با شیب 02/0±12/0) و ترکیب پیاز و فلفل (با شیب 01/0±12/0) اختلاف معنادار وجود ندارد (05/0<P) ولی روند افزایشی تعداد باکتری در گروه­های فلفل به تنهایی و ترکیب پیاز و فلفل به صورت معنادار کندتر از گروه کنترل و گروه پیاز به تنهایی است (05/0>P)

بحث

 اخیرا به دلیل بروز مقاومت­های دارویی و طولانی بودن زمان درمان عفونت باکتری­های مقاوم به آنتی­بیوتیک، اولویت تحقیقات برای ساخت داروهای جدید و موثر افت پیدا کرده و اهمیت یافتن راهی جدید برای درمان دوچندان شده است. در این راستا با اثبات اثر ترکیبات گیاهی علیه طیف وسیعی از باکتری­ها، مخمرها و قارچ‌ها توجه تولیدکنندگان و مصرف­کنندگان به استفاده از این ترکیبات معطوف شده است (8). یکی از مهم­ترین مزایای ترکیبات گیاهی نسبت به داروهای سنتزی این است که بر خلاف این ترکیبات شیمیایی علاوه بر تاثیر مستقیم بر پیکر باکتری­ها محیط اطرافی را بر ضد آن‌ها و در جهت مهار رشدشان تغییر داده و به این ترتیب از ایجاد سویه­های میکروبی مقاوم به دارو نیز جلوگیری می‌شود (3).

استافیلوکوکوس اورئوس یکی از مهم­ترین میکروارگانیسم­های پاتوژن در مواد غذایی می­باشد که می­تواند عامل انتقال عفونت­های استافیلوکوکی و همچنین مسمومیت غذایی به انسان گردد (5). نتایج این مطالعه نشان داد که 3/73 درصد از نمونه­های بسته­بندی شده گوشت چرخ­کرده آلوده به استافیلوکوکوس اورئوس بودند. بالا بودن آلودگی در نمونه­های خام می تواند به دلایل مختلفی از جمله آلودگی اولیه و ثانویه (ناشی از آماده­سازی با دست و عدم رعایت صحیح اصول بهداشتی در حین آماده­سازی باشد (21). در مطالعه­ای که توسط Mustafa و همکاران در سال 2009 در یک پادگان نظامی در هند انجام گرفت، آلودگی 7/77 درصد از مواد گوشتی خام به استافیلوکوکوس اورئوس تایید شد که این میزان بسیار به مطالعه حاضر شباهت داشت (21). TavaKoli و همکاران در سال 2012 نیز در مطالعه­ای که بر روی غذاهای سرو شده در رستورآن‌های مراکز نظامی انجام دادند آلودگی 6/55 درصدی غذاهای گوشتی به استافیلوکوکوس اورئوس را گزارش نمودند (25). با اینکه این میزان آلودگی کمتر از نتایج این تحقیق بود ولی با توجه به اینکه نمونه­های مورد آزمایش آن‌ها غذاهای آماده مصرف بودند این میزان آلودگی بسیار قابل توجه می‌باشد.

در این تحقیق نمونه­های آلوده به باکتری استافیلوکوکوس اورئوس واجد ژن بتالاکتاماز نیز ردیابی شدند و نتایج نشان داد که 6/16 درصد از نمونه­ها آلوده به این سویه­ها بودند. فنوتیپ­های استافیلوکوکوس اورئوس مقاوم به آنتی­بیوتیک از نظر مسمومیت غذایی اهمیت زیادی ندارند زیرا این بیماری گوارشی از طریق مصرف آنتی­بیوتیک مدیریت نمی­شود اما فرضیه­ای وجود دارد که تماس، دستکاری و مصرف گوشت­های آلوده از دلایل انتقال و کلونیزه شدن باکتری استافیلوکوکوس اورئوس در روی پوست و مخاطات بینی و دهان می­باشد و بدین ترتیب حضور این سویه­های واجد مقاومت آنتی­بیوتیکی در نمونه­های خام و آماده مصرف حتی با میزان بسیار کمتر از نتیجه این تحقیق می­تواند سلامت عمومی جامعه را به طور جدی تهدید کند (6). مطالعات در مورد استافیلوکوکوس اورئوس­های جدا شده از گوشت بیشتر بر پایه استافیلوکوکوس اورئوس­های مقاوم به متی­سیلین (MRSA) بوده است و در ارتباط با باکتری­های حامل ژن اختصاصی بتالاکتاماز تحقیقات زیادی صورت نگرفته است. در این ارتباط Hanson و همکاران در سال 2011 شیوع استافیلوکوکوس اورئوس­های مقاوم به متی­سیلین در نمونه­های گوشت عرضه شده در فروشگاه­ها را مورد بررسی قرار دادند و میزان آلودگی 2/1 درصد را گزارش نمودند (12). همچنین در مطالعه­ای که توسط Igbinosa و همکاران در سال 2015 در نیجریه صورت گرفت 20 درصد از نمونه­های گوشت گاو آلوده به MRSA بودند (14).

نتایج این تحقیق نشان دهنده اثر خوب عصاره­های فلفل و پیاز بر ضد باکتری­های استافیلوکوکوس اورئوس واجد ژن بتالاکتاماز می‌باشد. این اثر ضد باکتریایی در مورد عصاره پیاز­قرمز می­تواند مربوط به حضور ترکیبات فلاونوئیدی و پلی فنلی موجود در این عصاره باشد که اثر مهاری آن‌ها بر رشد باکتری‌ها ثابت شده است (9). نتایج این مطالعه حاکی از تاثیر قوی­تر عصاره فلفل­قرمز نسبت به پیاز­قرمز در تمام تست­های ضد میکروبی و نمودار رشد میکروبی بود. در مطالعات پیشین ثابت شده است که عصاره­های بعضی از گیاهان از جمله فلفل علاوه بر اثر روی غشای باکتری­ها (که در مورد بسیاری از نگهدارنده­ها به عنوان تنها مکانیسم ضد میکروبی پیشنهاد می­شود) بر روی سنتز آنزیم­های مختلف باکتری­ها نیز نقش مهاری دارند (32). این مطلب می­تواند یکی از دلایل برتری عصاره فلفل­قرمز نسبت به پیاز­قرمز در این مطالعه باشد.

در مجموع نتایج این مطالعه نشان داد که عصاره­های فلفل­قرمز و پیازقرمز دارای اثر ضد باکتریایی بر استافیلوکوکوس اورئوس­های واجد ژن بتالاکتاماز جدا شده از گوشت­های چرخ­کرده می­باشند. با توجه به اینکه استفاده از منابع گیاهی در ایجاد سویه­های باکتریایی مقاوم به آنتی­بیوتیک تاثیر بسیار کمتری نسبت به نگهدارنده­های شیمیایی دارد، پیشنهاد می­شود در مطالعات آینده از مواد موثر این عصاره­ها به صورت خالص در فراوری محصولات گوشتی استفاده گردد و همچنین با اثبات اثر ضد میکروبی قوی­تر فلفل­قرمز توصیه می­شود در غذاهایی مانند انواع کباب که در آن‌ها از گوشت چرخ­کرده استفاده می­شود حتماً در کنار پیاز از فلفل نیز به میزان مناسب استفاده شود.

سپاسگزاری

نویسندگان مقاله مراتب تشکر و قدردانی خود را از خانم مهندس بهناز رئیسیان و خانم لیلا رضایی به خاطر کمک­های ارزنده­شان در مراحل کارهای آزمایشگاهی و ویراستاری مطالب اعلام می­دارند.

تعارض منافع

بین نویسندگان تعارض در منافع گزارش نشده است.

  1. Abew, B., Sahile, S., Moges, F. (2014). In vitro antibacterial activity of leaf extracts of Zehneria scabra and Ricinus communis against Escherichia coli and methicillin resistance Staphylococcus aureus. Asian Pac J Trop Biomed, 4(10), 816-820. https://doi.org/10.12980/APJTB.4.201414B16
  2. Adams, M., Moss, M. (2000). Food Microbiology, UK, Cambridge, 2nedn, The Royal Society of Chemistry. p. 256.
  3. Ani, V., Varadaraj, M., Naidu, K. A. (2006). Antioxidant and antibacterial activities of polyphenolic compounds from bitter cumin (Cuminum nigrum L.). Eur FoodRes Technol, 224(1), 109-115. http://dx.doi.org/10.1007/s00217-006-0408-8
  4. Atanassova, V., Meindl, A., Ring, C. (2001). Prevalence of Staphylococcus aureus and staphylococcal enterotoxins in raw pork and uncooked smoked ham—a comparison of classical culturing detection and RFLP-PCR. Int J Food Microbiol, 68(1-2), 105-113. https://doi.org/10.1016/S0168-1605(01)00479-2
  5. Best, N., Fraser, J. D., Rainey, P. B., Roberts, S. A., Thomas, M. G., Ritchie, S. R. (2011). Nasal carriage of Staphylococcus aureus in healthy Aucklanders. N Z Med J, 124(1332), 31-39.
  6. Bortolaia, V., Espinosa-Gongora, C., Guardabassi, L. (2016). Human health risks associated with antimicrobial-resistant enterococci and Staphylococcus aureus on poultry meat. Clin Microbiol Infect, 22(2), 130-140. https://doi.org/10. 1016 /j.cmi.2015.12.003
  7. Chambers, H. F. (2001). The changing epidemiology of Staphylococcus aureus? Emerging infectious diseases, 7(2), 178. PMID: 11294701
  8. Cohen, M. L. (1992). Epidemiology of drug resistance: implications for a post—antimicrobial era. Science, 257(5073), 1050-1055.
  9. Shinkafi, S. A., Dauda, H. (2013). Antibacterial Activity of Allium Cepa (Onion) On Some Pathogenic Bacteria Associated With Ocular Infections. Sch J App Med Sci, 1(3), 147-151.
  10. Ferreira, A. M., Martins, K. B., Silva, V. R. d., Mondelli, A. L., Cunha, M. d. L. R. d. (2017). Correlation of phenotypic tests with the presence of the blaZ gene for detection of beta-lactamase. Braz J Microbiol, 48(1), 159-166.   http://dx.doi. org/10.1016/j.bjm.2016.10.011  
  11. Gandomi, H., Abbaszadeh, S., JebelliJavan, A., Sharifzadeh, A. (2014). Chemical constituents, antimicrobial and antioxidative effects of Trachyspermum ammi essential oil. J. Food Process Preserv, 38(4), 1690-1695. https://doi.org/10.11 11/jfpp.12131
  12. Hanson, B., Dressler, A., Harper, A., Scheibel, R., Wardyn, S., Roberts, L., Smith, T. (2011). Prevalence of Staphylococcus aureus and methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) on retail meat in Iowa.  J Infect Public Health, 4(4), 169-174. https://doi.org/10.101 6/j.jiph.2011.06.001
  13. Haveri, M., Suominen, S., Rantala, L., Honkanen-Buzalski, T., Pyörälä, S. (2005). Comparison of phenotypic and genotypic detection of penicillin G resistance of Staphylococcus aureus isolated from bovine intramammary infection. Vet microbiol, 106 (1-2), 97-102. https://doi.org/10 .1016/j .vetmic.2004.12.015
  14. Igbinosa, E. O., Beshiru, A., Akporehe, L. U., Oviasogie, F. E., Igbinosa, O. O. (2016). Prevalence of methicillin-resistant Staphylococcus aureus and other Staphylococcus species in raw meat samples intended for human consumption in Benin City, Nigeria: implications for public health. Int J Environ Res Public Health, 13(10), 949. https://doi.org/1 0.3390 /ijerph 13100949
  15. Jay, J. M., Loessner, M., Golden, D. (2005). Modern food microbiology, USA, New York, 7 th,  Springer Since, Business Media, LLC. p. 480.
  16. Jebelli Javan, A. (2016). Combinational effects of Trachyspermum ammi and Zataria multiflora Boiss essential oils on some pathogenic food-borne bacteria. Koomesh, 17(2), 374-383.
  17. Khalifezade, S., Sadeghi, Z. M., Nahaee, M. (2015). Prevalence and antibiotics susceptibility of Staphylococcus aureus in traditional Kouzeh cheese at Saqqez retails. Journal of Food Hygiene, 4(16), 1-9.
  18. Lues, J., Van Tonder, I. (2007). The occurrence of indicator bacteria on hands and aprons of food handlers in the delicatessen sections of a retail group. Food control, 18(4), 326-332. https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2005.10.010
  19. Mitscher, L. A., Drake, S., Gollapudi, S. R., Okwute, S. K. (1987). A modern look at folkloric use of anti-infective agents. J Nat Prod, 50(6), 1025-1040. https://doi.org/10.1021 /np50054a003
  20. Mozdastan, S., Ebrahimzadeh, M. A., Khalili, M. (2015). Comparing the impact of different extraction methods on antioxidant activities of myrtle (Myrtus communis L.). J Mazandaran Uni Med Sci, 25(127), 10-24.
  21. Mustafa, M., Jain, S., Agrawal, V. (2009). Food poisoning outbreak in a military establishment. Armed Forces Med J India, 65(3), 240-243.
  22. Olsen, J. E., Christensen, H., Aarestrup, F. M. (2006). Diversity and evolution of blaZ from Staphylococcus aureus and coagulase-negative staphylococci. J Antimicrob Chemother. 57(3), 450-460.
  23. Pitkälä, A., Salmikivi, L., Bredbacka, P., Myllyniemi, A. L., Koskinen, M. (2007). Comparison of tests for detection of β-lactamase-producing staphylococci. J Clin Microbiol, 45(6), 2031-2033.
  24. Schwalbe, R., Steele-Moore, L., Goodwin, A.C. (2007). Antimicrobial susceptibility testing protocols, USA, New York, 3th  ed, Crc Press.  p. 564-566.
  25. Tavakoli, H., Farhang, K., A, K. Z., Heydari, E. (2012). Bacteriological quality of ready to eat food in four military restaurants. Journal Mil Med, 13(4), 207-212.
  26. Tavakoli, H. R., Riazipour, M. (2008). Microbial quality of cooked meat foods in Tehran University’s Restaurants. Pak J Med Sci, 24(4), 595-599.
  27. Trung, N.T., Hien, T.T.T., Huyen, T.T.T., Quyen, D.T., Binh, M.T., Hoan, P.Q. Velavan, T.P. (2015). Simple multiplex PCR assays to detect common pathogens and associated genes encoding for acquired extended spectrum betalactamases (ESBL) or carbapenemases from surgical site specimens in Vietnam. Ann Clin Microbiol Antimicrob, 14(1), 23.
  28. Uddin, B., Hossan, T., Paul, S., Ahmed, T., Nahar, T., Ahmed, S. (2010). Antibacterial activity of the ethanol extracts of Hibiscus rosa-sinensis leaves and flowers against clinical isolates of bacteria. Bangladesh J Life Sci, 22(2), 65-73.
  29. Udo, E. E., Al-Mufti, S.,  Albert, M. J. (2009). The prevalence of antimicrobial resistance and carriage of virulence genes in Staphylococcus aureus isolated from food handlers in Kuwait City restaurants. BMC Res Notes, 2(1), 108.
  30. Varnam, A. Evans, M. G. (1991). Foodborne Pathogens—an Illustrated Text. UK, London, )1st ed(.. Wolfe Publishing. p. 345.
  31. Zamanzad, B. (2010). The antibacterial properties of Allium cepa (onion) and Zingiber officinale (ginger) extracts on Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa Escherichia coli and Candida albicans isolated from vaginal specimens. J Shahrekord Univ Med Sci, 11(4), 81-87.
  32. Zaringhalam, M., Sattari, M., Zaringhalam, J., Rezazadeh, S. (2007). Effect of black pepper, red pepper and Zataria multiflora Boiss. alcoholic extracts on growth and DNase activity of Staphylococcus aureus. J Med Plants, 4(24), 17-21.
  33. Zarringhalam, M., Zaringhalam, J., Shadnoush, M., Safaeyan, F., Tekieh, E. (2013). Inhibitory effect of black and red pepper and thyme extracts and essential oils on enterohemorrhagic Escherichia coli and DNase activity of Staphylococcus aureus. Iran J Pharm Res, 12(3), 363. PMID: 24250643