مطالعه چند شکلی های تک نوکلئوتیدی ناحیه مجتمع عمده پذیرش بافتی مرتبط به سیستم ایمنی در مرغ های تجاری گوشتی و تخم گذار

نوع مقاله: میکروبشناسی و ایمنی شناسی

نویسندگان

1 گروه علوم دامی، دانشکده کشاورزی، واحد مراغه، دانشگاه آزاد اسلامی، مراغه، ایران

2 گروه علوم دامی، دانشکده علوم دامی و شیلات، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری، ساری، ایران

چکیده

زمینۀ مطالعه: ناحیه  مجتمع عمده پذیرش بافتی (MHC) مرغ‌ها در صفات تولیدی، پاسخ‌های ایمنی، مقاومت به بیماری‌های عفونی و روابط فیلوژنتیکی، دارای اهمیت زیادی است.
هدف: این تحقیق به منظور بررسی چند­شکلی­های تک نوکلئوتیدی ناحیه ژنی MHC مرتبط به سیستم ایمنی در مرغ­های تجاری گوشتی و تخم­گذار انجام گرفت.
روش‌کار: در این تحقیق یک‌صد نمونه خون از مرغ­های تجاری گوشتی و تخم­گذار اخذ و DNA­ی ژنومی به روش شستشوی نمکی استخراج شد. چند­شکلی­های­ آللی در جایگاه‌های ژنی B-L، B-F و B-Gبا استفاده از تکنیک PCR-RFLP و آنزیم­ Msp I بررسی شد.
نتایج: برای دو جمعیت تجاری گوشتی و تخم­گذار برای جایگاه تکثیری 374 جفت بازی B-L، تنها ژنوتیپ BB اما در جایگاه ژنی 1048 جفت بازی B-F، دو ژنوتیپ CG و GG فقط در مرغ­های تجاری گوشتی شناسایی شد. در این جایگاه ژنی آلل C شامل باندهای 515، 410، 75 و 47 جفت بازی و آلل G دارای باندهای 410، 302، 213، 75 و 47 جفت بازی بودند. در جایگاه ژنی 401 جفت بازی B-G، سه ژنوتیپ MM، MN و NN و دو آلل M شامل یک باند 401 جفت بازی و آلل N دارای دو باند 350 و 51 جفت بازی مورد شناسایی قرار گرفت. در کل جمعیت­ها، شاخص اطلاعات شانون در دو جایگاه ­ژنی B-F و B-G به ترتیب 45/0 و 73/0 و شاخص تثبیت به ترتیب 20/0- و 34/0 محاسبه شد. بیشترین مقدار شاخص هتروزیگوسیتی مشاهده ‌شده برای جایگاه­های ژنی B-F و B-G به ترتیب 34/0 و 23/0 برآورد شد.
نتیجه‌گیری نهایی:با توجه به تأیید وجود چندشکلی در دو جایگاه ژنی B-F(در جمعیت مرغ تجاری گوشتی) و B-G(در جمعیت­های مرغ­های تجاری گوشتی و تخم­گذار)، می‌توان از این جایگاه‌ها به ‌عنوان نشانگر ژنتیکی در برنامه­های اصلاح نژادی جهت افزایش مقاومت به بیماری­ها‌ استفاده کرد.

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Study of Single Nucleotide Polymorphisms of Major Histocompatibility Complex Region Related to the Immune System in Commercial Broiler and Layer Chickens

نویسندگان [English]

  • Jafar Pish Jang Aghajeri 1
  • Ghodrat Rahimi Mianji 2
  • Seyyed Hassan Hafezian 2
  • Mohsen Gholizadeh 2
1 Department of Animal Sciences, Faculty of Agriculture, Maragheh Branch, Islamic Azad University, Maragheh, Iran
2 Department of Animal Sciences, Faculty of Animal Sciences and Fisheries, Sari Agricultural Sciences and Natural Resources University, Sari, Iran
چکیده [English]

BACKGROUND: Chicken major histocompatibility complex region (MHC) is important in the productive traits, immune responses, resistance to infectious diseases and phylogenetic relationships.
OBJECTIVES: This study was investigated for single nucleotide polymorphisms of MHC region related to the immune system in commercial broiler and layer chickens.
METHODS: One hundred blood samples were taken from commercial broiler and layer chickens and genomic DNA was extracted by salting out method. The allelic polymorphisms were investigated in B-L, B-F and B-G loci using PCR-RFLP and MspI enzyme.
RESULTS: For two commercial broiler and laying populations, in the 374 bp locus of B-L, only BB genotype was detected but in the 1048 bp locus of B-F, two genotypes of CG and GG were identified in broiler chickens. The C allele contained four bands of 515, 410, 75 and 47 bp, and the G allele with five bands of 410, 302, 213, 75 and 47 bp. In B-G (401 bp) locus, three genotypes of MM, MN and NN and two alleles of M with one band (401 bp) and N with two bands (350 and 51 bp) were identified. In total populations, the Shannon information index was calculated to be 0.45 and 0.73 in markers loci of B-F and B-G, and the fixation index values were -0.20 and 0.34, respectively. The highest observed heterozygosity index for B-F and B-G loci was 0.34 and 0.23, respectively.
CONCLUSIONS: Considering the confirmation of the presence of polymorphism in two loci of the B-F (in commercial broiler population) and B-G (in commercial broiler and layer populations), these sites can be used as genetic marker in breeding programs to increase resistance to diseases.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Commercial chicken
  • Immune system
  • MHC
  • PCR-RFLP
  • Polymorphism

مقدمه

 صنعت پرورش مرغ به دلیل صرفه‌ اقتصادی اهمیت زیادی دارد و بیماری‌های مختلف می‌توانند اثرات نامطلوب زیادی روی صنعت پرورش مرغ یک کشور داشته باشند. امروزه اصلاح نژاد طیور باید جهت افزایش مقاومت ژنتیکی در برابر بیماری­ها باشد و نتیجه­ی این عمل استفاده اندک از داروها خواهد بود (8،14). امروزه انتخاب لاین‌های تجاری با رشد و تولید بیشتر و ضریب تبدیل کمتر باعث کاهش تنوع ژنتیکی، اختلالات فیزیولوژیک و ضعف کلی در دستگاه ایمنی شده است (13). کاهش تنوع ژنتیکی منجر به ایجاد جمعیت‌هایی با توان مقابله­ی کم در مقابل بیماری­های جدید می­شود و این امر برای صنعت پرورش مرغ خطری جدی به شمار می­رود (11،28). اخیراً در برنامه­های اصلاح نژاد مرغ­ها تولید لاین­های مقاوم به بیماری­ها، پاسخ­دهی بهتر به واکسن­ها و صفات تولیدی مورد توجه بسیاری از پژوهشگران قرار گرفته است و تشخیص مقاومت ژنتیکی به بیماری­ها با اهداف کنترل و پیشگیری، یک اصل کاربردی در اصلاح نژاد است (3،16،29،33).

 

یکی از واسطه‌­های اصلی در برقراری ارتباط بین سلول‌های ایمنی و پروتئین‌های غشاء، مولکول‌های وراثتی از جمله مجتمع عمده­ پذیرش بافتی (MHC) است (4،10،17). مهم‌ترین و مؤثرترین ژن‌های کنترل ‌کننده مقاومت نسبت به بیماری‌ها در این ناحیه ژنی قرار دارند (27). MHC در مرغ (مجموعه B) به طول 92 کیلو­باز به شکلی بسیار متراکم روی ­میکروکروموزوم شماره 16 قرار دارد (18) و طول آن 20 برابر کوچک‌تر از ناحیه­ی ژنی MHC پستانداران بوده و شامل سه کلاس یک، دو و چهار (I، II و IV) که به ترتیب با نام‌هایBF، BL و BG معروف است. مولکول‌های کلاس I و II تنوع بالایی داشته و مسئول عرضه آنتی‌ژن‌های داخلی و خارجی به لنفوسیت‌های T هستند (4،18). ژن‌های ناحیه­ی ژنی MHC با مقاومت یا حساسیت به برخی از بیماری‌های خود ایمن، ویروسی، باکتریایی و انگلی در ارتباط بوده و همچنین بسیاری از خصوصیات دیگر غیر وابسته به سیستم ایمنی نیز، مثل میزان تولید در مرغ­ها، توسط ناحیه ژنی MHC کنترل می‌شوند. ژن‌های ناحیه­ی ژنی MHC در مرغ‌ها، جهت انتخاب لاین‌های مقاوم به بیماری‌ها با پاسخ‌دهی بهتر به واکسن‌ها و انتخاب ویژگی‌های پرورشی مؤثر مثل تولید تخم‌مرغ، وزن بدن، میزان جوجه درآوری و باروری مورد توجه قرار می‌گیرند (6).

به دلیل نقش کلیدی ژن‌های ناحیه­ی ژنی MHC مرغ‌ها در پاسخ‌های ایمنی، ارتباط با بیماری‌های عفونی و تنوع آن‌ها در ارتباط با تکامل، در دو دهه اخیر مطالعات زیادی روی ژن‌های یاد شده انجام شده است (22). جهت بررسی چندشکلی ناحیه­ی ژنی MHC تاکنون روش­های متعددی مثل الکتروفورز 2 بعدی، ساترن بلاتینگ، PCR-RFLP، PCR-SSCP، RAPD، AFLP، PASA، SNP، STS و Microsatellite مورد استفاده قرار گرفته­اند (5،7،9،12،23،35). اگر چه در ایران مطالعات مولکولی با تکنیک­های متعدد روی مرغ­ها انجام شده است (1،6،20،21،25،28،34) اما تاکنون ناحیه مجتمع عمده­ی پذیرش بافتی در مرغ­های بومی یا تجاری در حد انتظار مورد بررسی قرار نگرفته است، لذا به دلیل عدم مطالعه­ی وجود چندشکلی­های احتمالی ناحیه ژنی MHC مرغ­های تجاری موجود در ایران با تکنیک PCR-RFLP، تحقیق حاضر به بررسی چندشکلی‌های آللی در کلاس­های I، II و IV ناحیه مجتمع عمده­ پذیرش بافتی (MHC) در مرغ­های تجاری گوشتی و تخم­گذار موجود در ایران پرداخته است. با توجه به نقش اساسی ناحیه ژنی MHC در کنترل بیماری­های مختلف و صفات تولیدی مرغ­ها، شناسایی چندشکلی­های ناحیه­ی ژنی یاد شده در جمعیت­های مورد مطالعه می­تواند جهت ایجاد مقاومت به بیماری و یا تهیه واکسن­های مؤثر به کار رود.

مواد و روش‌کار

در این پژوهش یک‌صد نمونه خون (هر جمعیت به تعداد 50 عدد) از دو جمعیت مرغ­های تجاری گوشتی (راس) و تخم­گذار‌ (شیور) موجود در مزارع پرورشی منظقه­ی آذربایجان شرقی به ‌اندازه 1 میلی‌لیتر خون از سیاهرگ بالی اخذ گردید. نمونه‌های خون در لوله‌های حاوی ماده ضد انعقاد خون در مجاورت یخ به آزمایشگاه ژنتیک و بیوتکنولوژی دانشگاه آزاد اسلامی واحد مراغه منتقل و تا زمان شروع استخراج DNA‌ی ژنومی و آزمایش‌های بعدی، در دمای 20- درجه سانتی­گراد نگه‌داری شدند. استخراج DNA­ی ژنومی نمونه­های خون با استفاده از روش شستشوی نمکی (19) انجام گرفت. کمیت DNA­های ژنومی استخراج شده به روش طیف سنجی و با استفاده از اسپکتروفتومتر نانودراپ و کیفیت ­DNA­ی ژنومی با الکتروفورز روی ژل آگارز 2 درصد تعیین شد. جهت تکثیر هر جایگاه ژنی از یک جفت آغازگر اختصاصی استفاده شد (جدول 1). اختصاصی بودن آغازگرهای مورد استفاده، از سرویس BLAST (Basice Local Alignment Search Tool) در سایت NCBI بررسی شد.

واکنش PCR در حجم نهایی 20 میکرولیتر شامل 200 – 100 نانوگرم DNAی ژنومی، 4 میکرولیتر  Taq DNA polymerase 2X Master mix red(Taq DNA polymerase، بافر، dNTPs، Red dye و Mgcl2) (ساخت شرکت AMPLIQON) و 6/0 میکرولیتر از هر یک از آغازگرهای رفت ‌و برگشت (ساخت شرکت BiONEER) با غلظت 10 پیکومول برای تکثیر منطقه‌ای به اندازه 374 جفت باز از اگزون شماره دو جایگاه ژنی B-L، انجام گرفت. واکنش زنجیره­ای پلیمراز در دمای واسرشته سازی اولیه 95 درجه­ی سانتی­گراد به مدت پنج دقیقه و 35 چرخه شامل واسرشته سازی ثانویه در دمای 97 درجه سانتی­گراد به مدت 60 ثانیه، دمای اتصال آغازگرها 56 درجه سانتی­گراد به مدت 60 ثانیه، دمای تکثیر 72 درجه سانتی­گراد به مدت 90 ثانیه و دمای تکثیر نهایی 72 درجه سانتی­گراد به مدت هشت دقیقه انجام گرفت.

تکثیر منطقه‌ای به ‌اندازه 1048 جفت باز از اگزون شماره دو تا اگزون شماره­ چهار جایگاه ژنی B-F، با استفاده از واکنش PCR در حجم نهایی 20 میکرولیتر شامل 200 – 100 نانوگرم DNAی ژنومی، 7 میکرولیتر Taq DNA polymerase 2X Master mix red (Taq DNA polymerase، بافر، dNTPs، Red dye و Mgcl2) (ساخت شرکت AMPLIQON) و 4/0 میکرولیتر از هر یک از آغازگرهای رفت ‌و برگشت (ساخت شرکت BiONEER) با غلظت 10 پیکومول انجام گرفت. برای این جایگاه ژنی واکنش زنجیره­ای پلیمراز با دمای واسرشته سازی اولیه 95 درجه­ سانتی­گراد به مدت پنج دقیقه و 30 چرخه شامل واسرشته سازی ثانویه در دمای 95 درجه سانتی­گراد به مدت 60 ثانیه، دمای اتصال آغازگرها 60 درجه سانتی­گراد به مدت 45 ثانیه، دمای تکثیر 72 درجه­ سانتی‌گراد به مدت 45 ثانیه و دمای تکثیر نهایی 72 درجه­ سانتی‌­گراد به مدت پنج دقیقه انجام شد.

همچنین تکثیر منطقه­ای به‌ اندازه 401 جفت باز از اینترون شماره یک و اگزون شماره دو از جایگاه ژنی B-Gبا استفاده از واکنش PCR در حجم نهایی 20 میکرولیتر شامل 200 – 100 نانوگرم DNAی ژنومی، 7 میکرولیتر Taq DNA polymerase 2X Master mix red (Taq DNA polymerase، بافر، dNTPs، Red dye و Mgcl2) (ساخت شرکت AMPLIQON) و 4/0 میکرولیتر از هر یک از آغازگرهای رفت ‌و برگشت (ساخت شرکت BiONEER) با غلظت 10 پیکومول انجام گرفت. برای این جایگاه ژنی واکنش زنجیره­ای پلیمراز با دمای واسرشته سازی اولیه 95 درجه­ی سانتی­گراد به مدت پنج دقیقه و 35 چرخه شامل واسرشته سازی ثانویه در دمای 95 درجه سانتی­گراد به مدت 30 ثانیه، دمای اتصال آغازگرها 50 درجه­ سانتی­گراد به مدت 30 ثانیه، دمای تکثیر 72 درجه­ سانتی­گراد به مدت 30 ثانیه و دمای تکثیر نهایی 72 درجهی سانتی­گراد به مدت چهار دقیقه انجام شد. قطعات تکثیر شده برای هر جایگاه ژنی در حضور نشانگر وزن مولکولی 100 جفت بازی (ساخت شرکت Thermo Scientific) روی ژل آگارز 2 درصد الکتروفورز شدند و صحت تکثیر قطعات مورد نظر بدون حضور باندهای غیراختصاصی و محصولات ناخواسته تائید شد (تصویرهای1،2،3).

 

جدول 1. توالی آغازگر­ها، اندازه­ی محصولات PCR و آنزیم­­های برشی برای هضم قطعات ژنی.

جایگاه ژنی

آغازگر

اندازه جایگاه ژنی (جفت باز)

آنزیم برشی

 (B-L)

F: 5′-CAGCGTTCTTCTTCTGCGGT-3′

R: 5′-TCACCTTGGGCTCCACTGCG-3′

374

Msp I

Xu و همکاران (2007)

(B-F)

F: 5′-GCAGAGCTCCATACCCTGCG-3′

R: 5′-GGTGTGGTACGTGCCGTCGCC-3′

1048

Msp I

Lima-Rosa (2004)

(B-G)

F: 5′-TGTCTCTTCTTCACCTCCACC-3′

R: 5′-GCAGTTCTGTTCTCCCTTCAT-3′

401

Msp I

Xu و همکاران (2005)

 

جدول 2. فراوانی­های آللی، ژنوتیپی و هتروزیگوسیتی مشاهده‌ شده و مورد انتظار برای جایگاه ژنی B-L در جمعیت­های مرغ­های تجاری مورد مطالعه.

 

آلل و ژنوتیپ

مرغ تجاری

کل جمعیت‌ها

تخم­گذار

گوشتی

فراوانی آللی

A

0

0

0

B

1

1

1

فراوانی ژنوتیپی مشاهده‌ شده (مورد انتظار)

AA

-

-

-

AB

-

-

-

BB

-

-

-

کای اسکور 1

-

-

-

فراوانی هتروزیگوسیتی (هموزیگوسیتی) مشاهده ‌شده

0 (1)

0 (1)

0 (1)

فراوانی هتروزیگوسیتی (هموزیگوسیتی) مورد انتظار

0 (1)

0 (1)

0 (1)

شاخص اطلاعات شانون

0

0

0

شاخص تثبیت

-

-

-

 

1- Chi-square test for Hardy-Weinberg equilibrium.

 


در پژوهش حاضر از تکنیک PCR-RFLP جهت تعیین چند­شکلی­ جایگاه­های ژنی مورد نظر و برای هضم آنزیمی محصولات PCR از آنزیم­ برشی اختصاصیMsp I (ساخت شرکت Thermo Scientific) استفاده شد (جدول 1). این واکنش­ها در حجم نهایی 5/15 میکرولیتر، شامل 5 میکرولیتر محصول PCR، 1 میکرولیتر بافر و 5/0 میکرولیتر آنزیم و در نهایت 9 میکرولیتر آب دو بار تقطیر انجام گرفت. واکنش­های هضم آنزیمی برای سه جایگاه ژنی در دمای 37 درجه­ی سانتی­گراد و به مدت 16 ساعت انجام شد. بعد از هضم آنزیمی محصولات PCR، برای مشاهده­ی باندها و تعیین الگوهای ژنوتیپی از ژل آگارز 4 درصد و نشانگر وزن مولکولی 50 جفت بازی (ساخت شرکت Thermo Scientific) استفاده شد.

جدول 3. فراوانی­های آللی، ژنوتیپی و هتروزیگوسیتی مشاهده‌ شده و مورد انتظار برای جایگاه ژنی B-F در جمعیت­های مرغ­های تجاری مورد مطالعه.

 

آلل و ژنوتیپ

 

مرغ تجاری

کل جمعیت‌ها

تخم­گذار

گوشتی

فراوانی آللی

C

0

34/0

17/0

G

1

66/0

83/0

فراوانی ژنوتیپی مشاهده‌ شده (مورد انتظار)

CC

-

0 (11/0)

0 (02/0)

CG

-

68/0 (45/0)

34/0 (29/0)

GG

-

32/0 (44/0)

66/0 (69/0)

کای اسکور 1

-

* 81/12

* 05/4

فراوانی هتروزیگوسیتی (هموزیگوسیتی) مشاهده ‌شده

0 (1)

68/0 (32/0)

34/0 (66/0)

فراوانی هتروزیگوسیتی (هموزیگوسیتی) مورد انتظار

0 (1)

45/0 (55/0)

28/0 (72/0)

شاخص اطلاعات شانون

0

64/0

45/0

شاخص تثبیت

-

51/0-

20/0-

 

* Significant (P < 0.05).1- Chi-square test for Hardy-Weinberg equilibrium.

جدول 4. فراوانی­های آللی، ژنوتیپی و هتروزیگوسیتی مشاهده‌ شده و مورد انتظار برای جایگاه ژنی B-G در جمعیت­های مرغ­های تجاری مورد مطالعه.

 

آلل و ژنوتیپ

مرغ تجاری

کل جمعیت‌ها

تخم­گذار

گوشتی

فراوانی آللی

M

22/0

23/0

23/0

N

78/0

77/0

77/0

فراوانی ژنوتیپی مشاهده‌ شده (مورد انتظار)

MM

22/0 (04/0)

0 (05/0)

11/0 (04/0)

MN

0 (35/0)

46/0 (36/0)

23/0 (35/0)

NN

78/0 (61/0)

54/0 (59/0)

66/0 (61/0)

کای اسکور 1

* 52

* 23/4

* 04/12

فراوانی هتروزیگوسیتی (هموزیگوسیتی) مشاهده ‌شده

0 (1)

46/0 (54/0)

23/0 (77/0)

فراوانی هتروزیگوسیتی (هموزیگوسیتی) مورد انتظار

35/0 (65/0)

35/0 (65/0)

35/0 (65/0)

شاخص اطلاعات شانون

52/0

53/0

73/0

شاخص تثبیت

1

29/0-

34/0

 

* Significant (P < 0.05). 1- Chi-square test for Hardy-Weinberg equilibrium.

 


نتایج

بعد از هضم آنزیمی قطعه ژنی B-L، فقط سه باند 150، 129 و 95 جفت بازی و در نتیجه یک ژنوتیپ(BB) در تمامی نمونه‌ها شناسایی شد. در قطعه ژنی B-Fبعد از هضم آنزیمی دو نوع ژنوتیپ CG و GGدر نمونه‌های مورد مطالعه شناسایی شد. آللCشامل باندهای 515، 410، 75 و 47 جفت بازی و آلل G دارای باندهای 410، 302،213، 75 و 47 جفت بازی بودند. همچنین بعد از هضم آنزیمی قطعه ژنی B-G سه ژنوتیپ MM، MN و NN شناسایی شد که آلل M دارای یک باند 401 جفت بازی و آلل N دارای دو باند 350 و 51 جفت بازی بودند (تصویر 4). برای آنالیز ژنتیکی داده­های حاصل از هضم آنزیمی در جمعیت‌های مورد مطالعه از نرم‌افزار POPGENEنسخه­ی 32/1جهت برآورد فراوانی­های آللی و ژنوتیپی، هتروزیگوسیتی مشاهده‌ شده و مورد انتظار، شاخص تعادل هاردی – واینبرگ، شاخص تثبیت، شاخص اطلاعات شانون و دیگر پارامترهای ژنتیکی استفاده شد.

تصویر 1. مشاهده­ محصولات PCR برای جایگاه­ ژنی B-L روی ژل آگارز 2 درصد با نشانگر وزن مولکولی 100 جفت باز.

 

تصویر 2. مشاهده­ محصولات PCR برای جایگاه ژنی B-F روی ژل آگارز 2 درصد با نشانگر وزن مولکولی 100 جفت باز.

 

تصویر 3. مشاهده­ محصولات PCR برای جایگاه­ ژنی B-G روی ژل آگارز 2 درصد با نشانگر وزن مولکولی 100 جفت باز.

 

تصویر 4. الگوهای ژنوتیپی مشاهده‌ شده حاصل از هضمی آنزیمی محصولات PCR برای هر یک از جایگاه­های ژنی مورد مطالعه روی ژل آگارز 4 درصد با نشانگر وزن مولکولی 50 جفت باز.

بحث

در تحقیق حاضر در مجموع یک‌صد نمونه­ی مرغ­های تجاری گوشتی و تخم­گذار برای سه جایگاه‌ ژنی تعیین ژنوتیپ شدند. جایگاه ژنی B-L یک‌شکل بوده و در دو جمعیت‌ یاد شده فقط آلل B شناسایی شد (جدول 2) که با مطالعه صورت گرفته توسط Sivaraman و Kumar در سال 2005 مطابقت داشت. آن‌ها چندشکلی جایگاه ژنی B-L (به طول 267 جفت باز) را در دو نوع لاین مرغ‌های گوشتی با استفاده از سه نوع آنزیم برشی Hae III، Msp Iو Taq I، مورد بررسی قرار داده و الگوهای برشی حاصل در همه­ی نمونه­ها یک‌شکل بودند (30). در ضمن نتایج تحقیق ما با بررسی‌های انجام شده توسط Oh و همکاران در سال 2005 و Xu و همکاران در سال 2007  مطابقت نشان نداد. Oh و همکاران در سال 2005 این جایگاه ژنی را در مرغ‌های کره‌ای به طول‌های 427 و 651 جفت باز تکثیر و با آنزیم برشی Hea III برش داده و برای هر منطقه مورد مطالعه سه نوع ژنوتیپ شناسایی کرده بودند (24). Xu و همکاران در سال 2007 نیز در مرغ‌های چینی روی چندشکلی این جایگاه ژنی با استفاده از تکنیک SSCP-PCR مطالعه­ای را انجام داده بودند و در نتیجه 31 آلل مختلف را در بین جمعیت­های مرغ‌های چینی مشخص کرده بودند (32). تفاوت در نتایج مشاهده شده احتمالاً می­تواند به دلیل استفاده از آنزیم­های برشی متفاوت، تفاوت در نوع سویه­ها­ی مرغ­های تجاری و تفاوت در تکنیک مورد استفاده باشد.

 

در جایگاه ژنی B-F فراوانی آلل‌های C و G به ترتیب در جمعیت تجاری گوشتی 34/0 و 66/0 اما در جمعیت مرغ­های تجاری تخم­گذار فقط آلل G مشاهده شد و در نتیجه همه­ نمونه­ها برای این جایگاه یک‌شکل بود. در جمعیت‌ مرغ­های تجاری گوشتی فراوانی هتروزیگوسیتی و هموزیگوسیتی مشاهده ‌شده در این جایگاه ژنی به ترتیب برابر 68/0 و 32/0 محاسبه شد. 2χ محاسبه­ شده در این جایگاه ژنی برای جمعیت­ تجاری گوشتی معنی­دار بود (05/0 >P) فلذا این جمعیت­ در تعادل هاردی - واینبرگ قرار نداشت (جدول 3). این نتایج با تحقیق انجام ‌شده توسط Lima-Rosa و همکاران در سال 2004 مطابقت داشت. آن­ها با تکنیک متفاوت روی مرغ برزیلی تخم آبی برای تعیین تغییرات توالی 1048 جفت بازی جایگاه ژنی یاد شده انجام داده و 23 توالی را شناسایی به طوری که ده تا از توالی­ها به ­عنوان توالی جدید گزارش شده بود (15). نتایج مرتبط به وفور آللی و ژنوتیپی در تحقیق ما با نتایج مطالعه Nikbakht Brujeni و Barjesteh در سال 2009 که روی جمعیت مرغ مادر و هیبریدهای تجاری گوشتی آرین انجام گرفته بود، مطابقت نداشت. آن­ها تنوع ژنتیکی جایگاه ژنی یاد شده را استفاده از تکنیک PCR-SSCP در 65 نمونه DNA شامل 25 نمونه متعلق به جمعیت مادر و 40 نمونه از مرغ‌های تجاری گوشتی آرین را مورد بررسی قرار داده و در هر دو جمعیت هفت الگوی مختلف مشخص کرده که دو الگو در دو جمعیت مشابه و پنج الگوی دیگر به ‌عنوان الگوی جدید شناسایی شده بودند (22). تکنیک­های متفاوت و همچنین سویه­های متفاوت مورد استفاده در این تحقیقات، احتمالاً می­تواند دلیل تفاوت در نتایج به دست آمده باشد.

در جایگاه ژنی B-G بیشترین مقدار فراوانی آلل‌های M و N به ترتیب مربوط به مرغ‌های تجاری گوشتی (23/0) و تخم­گذار (78/0) بود. در کل جمعیت‌ها، میانگین فراوانی آلل‌های M و N به ترتیب 23/0 و 77/0 و همچنین میانگین فراوانی‌های ژنوتیپ‌های مشاهده شده MM، MN و NN به ترتیب 11/0، 23/0 و 66/0 برآورد شد. 2χ محاسبه ­شده در این جایگاه ژنی برای جمعیت­­های تجاری گوشتی و تخم­گذار معنی­دار بود (05/0 > P) و جمعیت­های ذکر شده در تعادل هاردی - واینبرگ قرار نداشتند (جدول 4). این نتایج با نتایج تحقیق Xu و همکاران در سال 2005  مطابقت داشته اما با نتایج تحقیق Ri - Fu و همکاران در سال 2006 مطابقتی نداشت. Xu و همکاران در سال 2005 با استفاده از دو نوع آنزیم برشی جایگاه ژنی یاد شده به طول 401 جفت باز را در هشت نژاد مختلف از مرغ‌های بومی و هیبرید گوشتی برش داده بودند. با استفاده از آنزیم Msp I دو ژنوتیپ AA و AB به ترتیب با فراوانی‌های 6276/0 و 3724/0 و فراوانی آلل‌های A و B به ترتیب 8138/0 و 1862/0 محاسبه و با استفاده از آنزیم Tas I سه نوع ژنوتیپ مختلف AA، AB و BB به ترتیب با فراوانی‌های 0962/0، 4647/0 و 4391/0 مشاهده و فراوانی آلل‌های A و B به ترتیب 3285/0 و 6715/0 برآورد کرده بودند (31). Ri - Fu و همکاران در سال 2006 با تکنیک­ متفاوت مطالعه­ای جهت بررسی چندشکلی ژنتیکی اگزون شماره دو منطقه ژنی B-G در هشت نژاد مختلف از مرغ‌های چینی انجام داده بودند و در نتیجه 31 آلل جدید را مورد شناسایی قرار داده بودند (26). تفاوت­ در فراوانی ژنی و ژنوتیپی می­تواند به دلیل تکنیک مورد استفاده و همچنین منشأ متفاوت جغرافیایی این جمعیت‌ها یا سطوح مختلف انتخاب باشد. انحراف از تعادل هاردی - واینبرگ، نشان ‌دهنده تغییر فراوانی­های آللی در یک جمعیت است. این تغییر را می­توان به تعدادی از عوامل از ­جمله رانش ژنتیکی که در جمعیت­هایی با تعداد افراد کم رخ می­دهد، نسبت داد.

در نتایج به ‌دست ‌آمده از این تحقیق، در کل جمعیت­ها، شاخص اطلاعات شانون در دو جایگاه ­ژنی B-F و B-G به ترتیب 45/0 و 73/0 و شاخص تثبیت به ترتیب 20/0- و 34/0 محاسبه شد. بیشترین مقدار شاخص هتروزیگوسیتی مشاهده ‌شده برای جایگاه­های ژنی B-F و B-G به ترتیب برابر با 34/0 و 23/0 برآورد شد. برآورد شاخص تثبیت منفی در مرغ‌های تجاری مورد مطالعه می­تواند به دلیل شدت انتخاب بالا و عدم تلاقی تصادفی در این جمعیت‌ها باشد. شاخص تثبیت همیشه در محدوده­ی 1- تا 1 متغیر است و منفی بودن آن نشانی از کاهش هتروزیگوسیتی و افزایش هموزیگوسیتی یا افزایش هم‌خونی و همچنین انحراف از تعادل هاردی - واینبرگ در جمعیت­ها باشد. شاخص اطلاعات شانون برآوردی از تنوع ژنتیکی در جمعیت­ها است. در کل جمعیت­های مرغ­های تجاری مورد مطالعه در این تحقیق، جایگاه ژنی B-G دارای تنوع ژنتیکی نسبتاً بالایی (73/0) بود (جداول 3،4).

اصولاً می­توان از چندشکلی‌های مشاهده شده در جایگاه‌های ژنی مرتبط به سیستم ایمنی برای مطالعات پاسخ ایمنی ژنوتیپ­های مشاهده شده جهت بهبود پاسخ عملکرد ایمنی در مرغ‌های تجاری بهره برد. با توجه به مشاهدات این تحقیق مبنی بر وجود چندشکلی در دو جایگاه ژنی B-F (جمعیت مرغ­های تجاری گوشتی) و B-G (جمعیت­های مرغ­های تجاری گوشتی و تخم­گذار)، می‌توان از این جایگاه‌ها به ‌عنوان نشانگر در استراتژی­های اصلاح نژادی جهت افزایش مقاومت به بیماری­ها‌ استفاده کرد.

سپاسگزاری

این پژوهش با همکاری و مساعدت دانشگاه آزاد اسلامی، واحد مراغه انجام گرفت. لذا مراتب تشکر و سپاسگزاری را از معاون محترم پژوهش و فن‌آوری و مدیر محترم آزمایشگاه­­ها و کارگاه­های این واحد دانشگاهی اعلام می­داریم.

تعارض منافع

بین نویسندگان تعارض در منافع گزارش نشده است.

  1. Basiri, R., Pish Jang, J., Ghorbani, A. (2015). Genetic diversity in the mitochondrial DNA of the Iranian common native and exotic chicken breeds. J Biodivers Environ Sci,7 (1), 537-542.
  2. Boonyanuwat, K., Thummabutra, S., Sookmanee, N., Vatchavalkhu, V., Siripholvat, V. (2006). Influences of major histocompatibility complex class I haplotypes on avian influenza virus disease traits in Thai indigenous chickens. Anim Sci J, 77, 285-289. https://doi.org/10.1111/j.1740-0929.2006.00350.x
  3. Bumstead, N. (1998). Genetic resistance to avian viruses. Rev Sci Tech, 17, 249-255. https://doi.org/10.20506/rst.17.1.1082 PMID: 9638814
  4. Dietert, R.R. (1987). The major histocompatibility complex as a communication gene complex. Poult Sci,66, 774-775. https://doi.org/10.3382/ps.0660774 PMID: 3628160
  5. Emara,  M.G.,  Kim,  H.,  Zhu,  J.,  Lapierre, R.R., Lakshmanan,  N.,  Lillehojt,  H.S.  (2002). Genetic diversity at the major histocompatibility complex (B) and microsatellite loci in three commercial broiler pure lines. Poult Sci, 81, 1609-17. https://doi.org/10.1093/ps/81.11.1609 PMID: 12455584
  6. Esmailnejad, A., Nikbakht, G., Khazeni Oskoui, N., Amini, F. (2015). Allelic segregation of major histocompatibility complex using LEI0258 microsatellite marker in indigenous and commercial chickens. J Vet Res, 70(1), 101-107. https://doi.org/10.22059/jvr.2015.52978
  7. Fulton,  J.E.,  Juul - Madsen,  H.R.,  Ashwell,  A.M., McCarron,  A.M.,  Arthur,  J.A.,  O'Sullivan,  N.P., Taylor Jr, R.L. (2006). Molecular genotype identification of the Gallus gallus major histocompatibility complex. Immunogenetics, 58, 407-421. https://doi.org/10.1007/s00251-006-0119-0 PMID: 16738938
  8. Gibson, J.P., Bishop, S.C. (2005). Use of molecular markers to enhance resistance of livestock to disease. Rev Sci Tech, 24 (1), 343-353. PMID: 16110901
  9. Goto, R.M., Afanassieff, M., Ha, J., Iglesias, G.M., Ewald, S.J., Briles, W.E., Miller, M.M. (2002). Single - strand conformation polymorphism (SSCP) assays for major histocompatibility complex B genotyping in chickens. Poult Sci, 81, 1832-41. https://doi.org/10.1093/ps/81.12.1832 PMID: 12512574
  10. Hawken, R.J., Beattie, C.W., Schook, L.B. (1998). Resolving the genetics of resistance to infectious diseases. Am Eurasian J Agric Environ Sci, 17, 17-25. https://doi.org/10.20506/rst.1 7.1.1098 PMID: 9638798
  11. Hoffmann, I. (2009). The global plan of action for animal genetic resources and the conservation of poultry genetic resources. Worlds Poult Sci J,65, 286-297. https://doi.org/ 10.1017/S0043933909000245
  12. Iglesias, G.M., Soria, L.A., Goto, R.M., Jar, A.M., Miquel, M.C., Lopez, O.J., Miller, M.M. (2003). Genotypic variability at the major histocompatibility complex (B and Rfp-Y) in Camperos broiler chickens. Anim Genet, 34, 88-95. https://d oi.org/10.1046/j.1365-2052.2003.00944.x  PMID: 12648091
  13. Javanrouh Aliabad, A., Seyedabadi, H., Taheri Dezfuli, B. (2011). Association of insulin-like growth factor-I gene with body composition traits in Iranian commercial broiler lines. World Appl Sci J,14, 71-76.
  14. Jovanovic, S., Savic, M., Zivkovic, D. (2009). Genetic variation in disease resistance among farm animals. Biotechnol Anim Husb, 25 (5-6), 339-347. https://doi.org/ 10.2298/BAH0906339J
  15. Lima-Rosa, C.A.V., Canal, C.W., Streck, A.F., Freitas, L.B., Delgado-Canedo, A., Bonatto, S.L., Salzano, F.M. (2004). B-F DNA sequence variability in Brazilian (blue-egg Caipira) chickens. Anim Genet, 35, 278-284. https://doi.org/10.1111/j .1365-2052.2004.01160.x
  16. Lwelamira, J., Kifaro, G.C., Gwakisa, P.S., Msoffe, P.L.M. (2008). Association of LEI0258 microsatellite alleles with antibody response against Newcastle disease virus vaccine and body weight in two Tanzania chicken ecotypes. Afr J Biotechnol, 7, 714-720. https://doi.org/10.5897/AJB07.579
  17. Malo, D., Skamene, E. (1994). Genetic control of host resistance to infection. Trends Genet, 10, 365-371. https:/ /doi.org/10.1128/IAI.72.4.2395-2399.2004  PMID: 7985241
  18. Miller, M.M., Bacon, L.D., Hala, K., Hunt, H.D., Ewald, S.J., Kaufman, J., Zoorob, R., Briles, W.E. (2004). Nomenclature for the chicken major histocompatibility (B and Y) complex. Immunogenetics, 56, 261-279. https://doi.org/10.1007/s0025 1-004-0682-1 PMID: 15257423
  19. Miller, S.A., Dykes, D.D., Polesky, H.F. (1988). A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic Acids Res, 16 (3), 12-15. https://doi.org/10.3161/1733-5329(2006)8[277: TICTCD] 2.0.CO; 2 PMID: 3344216
  20. Moazeni, S., Mohammadabadi, M.R., Sadeghi, M., Shahrbabak, H., Koshkoieh, A., Bordbar, F. (2016a). Association between UCP gene polymorphisms and growth, breeding value of growth and reproductive traits in Mazandaran indigenous chicken. Open J Anim Sci, 6 (1), 1-8. https://doi.org/10.4236/ojas.2016.61001
  21. Moazeni, S.M., Mohammadabadi, M.R., Sadeghi, M., Moradi Shahrbabak, H., Esmailizadeh, A.K. (2016b). Association of the melanocortin - 3(MC3R) receptor gene with growth and reproductive traits in Mazandaran indigenous chicken. J Livest Sci Technol, 4 (2), 51-56. https://doi.org/10.22103 /jlst.2016.1513
  22. Nikbakht Brujeni, G., Barjesteh, N. (2009). A study of the genotypic variability at the MHC (B-F) in Arian broiler chickens by PCR - SSCP. J Vet Res,64 (1), 63-67.
  23. Nishibori, M., Nakaki, S., Tsudzuki, M., Yamamoto, Y. (2000). Utility of three restriction fragment length polymorphism probes for genotyping of the chicken major histocompatibility complex class IV region. Poult Sci, 79, 305-11. https://doi.org/10.1093/ps/79.3.305 PMID: 10735194
  24. Oh, J.D., Park, M.H., Kong, H.S., Lee, H.K., Jeon, G.J., Yeon, S.H., Sang, B.D., Choi, C.H., Cho, B.W. (2005). Characteristics and improving breed of economic traits of Korea native chicken. Korean J Poult Sci, 32 (1, 3), 29-34.
  25. Pish Jang, J., Rahimi, G., Hafezian, H., Gholizadeh, M. (2018). Identification of mutation in two candidate genes with resistance potential against avian influenza and salmonellosis in some Iranian indigenous and commercial chicken strains. Vet Res Biol Prod, 31 (2), 42-50. https://doi.org/10.22092/vj.2 017.116264.1382
  26. Ri - Fu, X., Kui., L., Guo - Hong, C., Yang - Zong, Q., Yu - Bo, Z., Li, L., Bin, F., Bang, L. (2006). Genetic polymorphism within exon 2 of MHC B-G gene in nine Chinese indigenous chicken breeds. Acta Zool Sin, 52 (1), 160-169.
  27. Schou, T.W., Labouriau, R., Permin, A., Christensen, J.P., Sorensen, P., Cu, H.P., Nguyen, V.K., Juul – Medsen, H.R. (2010). MHC haplotype and susceptibility to experimental infections (Salmonella Enteritidis, Pasteurella multocida or Ascaridia galli) in a commercial and an indigenous chicken breed. Vet Immunol Immunopathol,135, 52-63. https://doi .org/10.1016/j.vetimm.2009.10.030 PMID: 19945754
  28. Shahdadnejad, N., Mohammadabadi, M.R., Shamsadini, M. (2016). Typing of clostridium perfringens isolated from broiler chickens using multiplex PCR. Genet 3rd Millen, 14, 4368-4374.
  29. Sheldon, B.L. (2000). Research and development in 2000: Directions and priorities for the world’s poultry science community. Poult Sci, 78, 147-158. https://doi.org/10.1093 /ps/79.2.147
  30. Sivaraman, G.K., Kumar, S. (2005). PCR-RFLP chicken in BL-βII region of MHC of divergent broiler lines based on immunocompetence Index. J Appl Anim Res, 28, 81-84. https://doi.org/10.1080/09712119.2005.9706796
  31. Xu, R.F., Li, K., Chen, G.H., Qiang, B.Y.Z., Mo, D.L., Fan, B., Li, C.C., Yu, M., Zhu, M.J., Xiong, T.A., Liu, B. (2005). Investigation of PCR-RFLPs within Major Histocompatibility Complex B-G genes using two restriction enzymes in eight breeds of Chinese ındigenous chickens. Asian-Australas J AnimSci, 18 (7), 942-948. https://doi.org/10.5713/aj as.2005.942
  32. Xu, R.F., Li, K., Chen, G., Xu, H., Qiang, B., Li, Ch., Liu, B. (2007). Characterization of genetic polymorphism of novel MHC B-LBII alleles in Chinese Indigenous chickens. J Genet Genomics, 34 (2), 109-118. https://doi.org/10.1016/S1673-8527(07)60012-5 PMID: 17469783
  33. Yonash, N., Heller, E.D., Hillel, J., Cahaner, A. (2000). Detection of RFLP markers associated with antibody response in meat-type chickens: haplotype/genotype, single-band, and multiband analyses of RFLP in the major histocompatibility complex. J Hered, 91, 24-30. https://doi.org/10.1093/jher ed/91.1.24 PMID: 10739120
  34. Zandi, E., Mohammadabadi, M.R., Ezzatkhah, M., Esmailizadeh, A.K. (2014). Typing of toxigenic isolates of clostridium perfringens by multiplex PCR in ostrich. Iranian J App Anim Sci, 4(4), 795-801.
  35. Zhou, H., Lamont, S.J. (1999). Genetic characterization of biodiversity in highly inbred chicken lines by microsatellite markers.  Anim Genet, 30, 256-264. https://doi.org/10.1046/ j.1365-2052.1999.00505.x  PMID: 10467700